鱼类适应性免疫系统的早期发生以及Ikaros基因的克隆和表达

摘要

本论文第一部分主要研究了适应性免疫系统的早期发生和发育。我们选择的适应性免疫系统的关键基因是Rag2、AID、TCRAC、IgLC-J、mIg、sIg和Mznf297，首先对它们在斑马鱼的不同发育时期以及成鱼中的表达模式进行了研究，然后用LPS对斑马鱼的胚胎/幼鱼以及成鱼进行感染，进一步分析上述基因表达水平的变化。根据实验结果，我们发现除了Rag2和Mznf297之外，其余5个基因在胚胎发生早期以及幼鱼时期表达量都非常低，随着斑马鱼胚胎发育的进行，表达量也相应提高。而对于Rag2和Mznf297，在胚胎发育早期即原肠期，我们检测到了异常的高水平表达，推测可能是因为母源性的mRNA在发育早期大量存在于胚胎中导致。而随着幼鱼发育，二者的表达水平逐步稳定升高。当我们用LPS对胚胎/幼鱼进行感染后，发现大多数基因都做出了迅速应答，表达水平产生了明显变化。除IgLC-1和sIg之外，其余基因在受精后8天就发生了表达量的显著性提高，这表明适应性免疫系统在此时期已经可以对病原感染做出应答。而IgLG-1和sIg分别是在受精后23天和13天对LPS的刺激具有了较强的反应，表达量开始显著提升。据此，我们能够初步证明，斑马鱼胚胎/幼鱼的适应性免疫系统在个体发育的早期已经逐步建立起来，并且对抗原的侵袭具有了一定的反应能力，其发育成熟的时间可能会稍早于之前认为的4-6周。 在本论文的第二部分，我们从重要的经济鱼类半滑舌鳎中分离出了一个关键的血细胞分化相关因子-Ikaros基因。Ikaros的cDNA全长为1685 bp，其开放阅读框为1290 bp，编码430个氨基酸。5’非编码区为24 bp，3’非编码区为371 bp。用Ikaros基因的氨基酸序列与其他物种的Ikaros以及家族其他成员包括Helios、Aiolos和Eos的氨基酸序列构建系统进化树，发现半滑舌鳎中的Ikaros与包括青鳉、鰤鱼、虹鳟以及斑马鱼在内的鱼类展示了较近的亲缘关系，在进化树中聚为一支。进一步用部分物种Ikaros的保守区进行同源性比对，发现同源性较高的区域主要集中在N、C末端的锌指结构域。这同哺乳动物中的研究结果是一致的，即N末端和C末端的锌指结构在进化过程中变化较小，保守性较强。我们又利用DNAstar中的CLUSTAL W方法对Ikaros的氨基酸进行了结构上的相似度分析，结果与聚类分析一致，与青鳉、鰤鱼、虹鳟以及斑马鱼相似度较高，分别达80.0％、76.7％、66.7％以及57.3％。因为在其他物种早已证明Ikaros是调控免疫系统发生和发育的转录因子，为了验证它是否与免疫相关，我们首先利用实时定量RT-PCR技术检测了其在不同组织的表达情况。结果显示，Ikaros基因在半滑舌鳎中的胸腺、肝脏和脾中表达量较高，在肾脏、精巢和心脏中也有一定量的表达，而在肠、皮肤以及鳃中几乎检测不到或者表达量很低。这与美西螈、晶吻鰩和七鳃鳗中的检测结果基本一致，这表明了半滑舌鳎中的Ikaros基因在主要的免疫器官中均有表达，在表达模式上也具有一定的保守性。这暗示我们，半滑舌鳎中的Ikaros可能与其他物种的Ikaros一样，在免疫防御上具有一定的功能。我们从半滑舌鳎的头肾中分离出巨噬细胞，进行培养，然后用LPS或LTA对其刺激，收集不同处理样品并运用实时定量技术鉴定Ikaros基因的表达变化。结果表明，相比较于对照组，LPS或LTA处理后Ikaros表达量显著提高，这表明Ikaros基因是一种可以在巨噬细胞中表达的受LPS和LTA调控的免疫防御分子。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1鱼类免疫系统概述

1.1免疫器官和组织

1.2免疫细胞

1.3体液免疫因子

2免疫应答

2.1免疫应答的基本过程

2.2免疫应答的定位

2.3免疫应答的类型

3适应性免疫系统

3.1适应性免疫的反应类型

3.2适应性免疫的基本特征

3.3适应性免疫应答的过程

3.4适应性免疫因子的研究进展

4 Ikaros基因研究概况

4.1 IKaros家族

4.2 IKaros的结构

4.3 IKaros的功能

4.4 IKaros的表达

5研究意义和技术路线

第二章 斑马鱼类适应性免疫系统的早期发育

1前言

2材料与方法

2.1试验材料

2.2试验设计

2.3斑马鱼样品总RNA的提取

2.4 RNA的消化

2.5反转录

2.6实时定量PCR实验

2.7数据处理

3结果

3.1斑马鱼总RNA的提取

3.2反转录cDNA的质量检测

3.3引物特异性和扩增效率

3.4适应性免疫相关基因的实时定量PCR检测

4讨论

第三章半滑舌鳎IKaros基因的克隆和表达

1前言

2材料和方法

2.1试验材料

2.2试验试剂及配制方法

2.3半滑舌鳎总RNA的分离

2.4 IKaros基因全长的克隆

2.5序列比较与系统进化分析

2.6 IKaros基因的组织表达分析

2.7头肾中巨噬细胞的分离及培养

2.8实时定量PCR实验

3结果

3.1半滑舌鳎组织总RNA的提取

3.2 Ikaros的cDNA扩增

3.3 IKaros的序列分析

3.4 Ikaros的系统进化分析

3.5 Ikaros的相似度分析

3.6 Ikaros在半滑舌鳎成体各组织中的表达模式

3.7 LPS和LTA处理后Ikaros在巨噬细胞中的表达模式

4讨论

结论

参考文献

致谢

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