原位可注射壳聚糖基温敏水凝胶缓释体系的构建及其在牙周病治疗领域的应用研究

摘要

牙周病是发生在牙周支持组织的细菌感染性疾病，是一种在世界范围内广泛散播的常见病和多发病。牙周病不仅表现为牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的炎症和降解，而且被认为是其他系统性疾病的危险因子，如心血管疾病、中风和低体重早产儿。目前公认牙周病是多因素疾病，细菌菌斑及其产物是引发牙周病必需的始动因子。因此合理正确的使用抗生素治疗牙周病是必要的辅助手段，尤其对复发性和重度牙周病来讲更是不可或缺。 近年来由于全身应用抗生素的毒副作用及日益严重的细菌抵抗问题的出现，使得局部药物释放系统成为研究的热点。具有可生物降解和原位注射温度敏感水凝胶近十年来被高度关注，被认为是最方便、最可靠且最能够满足口腔科医师需要的牙周病局部给药剂型。 壳聚糖(Chitosan，CS)是天然生物多糖，大量文献报道壳聚糖无毒、无刺激性及无免疫源性；具有良好的生物相容性、生物粘附性、生物可降解性、抑菌性、促进伤口愈合、组织再生等优良特性及较好的可塑性。在生物医药领域被广泛用作药物释放载体、组织工程支架及抑菌剂等。壳聚糖季铵盐(Quaternized chitosan，HTCC)是将CS的氨基引入季铵基团引入CS分子链中而得到的一类壳聚糖衍生物，以改善CS水溶性差的缺点。 本试验中，利用CS与醚化剂2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)反应，制备HTCC，合成的HTCC取代度为74.5％。以CS及HTCC配合α，β-甘油磷酸(α，β-GP)制备原位可注射物理交联壳聚糖基温敏水凝胶(CS/HTCC-GP水凝胶)，此水凝胶中无任何化学交联剂。其溶胶-凝胶的转变时间可被控制在25℃以上。CS与HTCC的比例、α，β-GP的浓度均可控制转变温度和时间。当CS与HTCC的重量比为5/1、α，β-GP的终浓度为8.33％，37℃时的溶胶-凝胶转变时间为3 min。CS/HTCC-GP温敏水凝胶超微结构疏松、多孔，以利于水分子的自由通过。奥硝唑和氯已啶在人工唾液中的体外释放分别超过3 h和18 h，说明CS/HTCC-GP温敏水温敏水凝胶能够有效的延缓模型药物的体外释放率，而其中对氯已啶的缓释效果好于奥硝唑。 选用牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴防线放线杆菌3种牙周常见G-厌氧致病菌株为实验菌种，采用我国卫生部和美国国家标准化组织推荐厌氧菌药敏培养方法琼脂稀释法测定CS、HTCC及CS/HTCC-GP温敏水凝胶对三种牙周常见菌的最低抑菌浓度和抑菌环直径。结果表明，CS及HTCC对三种致病菌有较强的抑制活性，HTCC的抑菌活性较CS略强。WCS/WHTCC=5/1时具有最强的抑菌活性。载药温敏水凝胶较水凝胶基质或抗生素单纯对牙周常见致病菌的MIC显著减少，抑制活性显著增强。CS-HTCC/GP温敏水凝胶的抑菌环直径较CS-GP的大。 原代培养牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)，MTT比色法实验测定CS、HTCC和CS/HTCC-GP温敏水凝胶对细胞增殖的影响。结果显示CS在浓度0.2-2000μg/mL均对HPDLCs的增殖有促进作用。HTCC在浓度为0.2-10μg/mL能够促进HPDLCs的增殖，而浓度为50-2000μg/mL时，则有抑制细胞增殖的作用。含有不同浓度CS/HTCC-GP温敏水凝胶浸提液的培养基均有不同程度促进HPDLCs增殖的作用。 细胞透射电镜显示：浓度为1000μg/mL和3μg/mL的CS以及3μg/mL的HTCC作用下的HPDLCs的超微结构与正常对照组无显著差别。而浓度为1000μg/mL的HTCC表现出细胞溶解等严重的细胞破坏现象。含50％CS/HTCC-GP温敏水凝胶的浸提液的DMEM培养的HPDLCs的超微结构正常，未见细胞破坏现象。 应用流式细胞仪(FCM)对CS、HTCC和CS/HTCC-GP温敏水凝胶对HPDLCs的细胞周期检测。结果表明浓度为3μg/mL和3 mg/mL的CS能使细胞的G1％增多，S％减少。浓度为3μg/mL的HTCC，G1％细胞较对照组显著减少，S％显著增多；而浓度为1 mg/mL和3 mg/mL时均发生细胞凋亡率，凋亡率分别为10.6％和51.8％。CS/HTCC-GP温敏水凝胶可以加速HPLDCs的分化与增殖。 通过ELISA法测定CS、HTCC和CS-HTCC/GP对LPS介导HPDLCs分泌IL-1β和TNF-α的影响。CS在最初的48 h能够抑制LPS介导的HPDLCs分泌IL-1β和TNF-α。而HTCC在最初24 h就促进HPDLCs分泌IL-1β和TNF-α。bFGF对LPS介导的HPDLCs分泌IL-1β和TNF-α有显著的抑制作用。CS/HTCC-GP温敏水凝胶的浸提液能够不同程度的减少LPS介导的HPDLCs对IL-1β和TNF-α的分泌。 CS/HTCC-GP温敏水凝胶大鼠股部肌肉内原位注射结果表明，CS/HTCC-GP温敏水凝胶具有良好的组织相容性。毒理学实验结果表明：CS、HTCC、CS/HTCC-GP、CS/HTCC-GP-1％Onz和CS/HTCC-GP-0.1％Chx温敏水凝胶临床使用安全。 并通过建立犬牙周组织缺损病理模型，检测CS/HTCC-GP温敏水凝胶对牙周组织再生的作用。结果表明CS/HTCC-GP温敏水凝胶是良好的生长因子载体，具有较强的促进组织再生的作用。 所有以上实验结果提示，CS/HTCC-GP温度敏感水凝胶表现出良好的生物相容性和生物功能性，是牙周局部缓释药物载体和组织工程支架的理想选择。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

0.1壳聚糖及其衍生物在牙周病领域的应用进展

0.1.1作为牙周致病菌的抑菌剂

0.1.2牙周病局部缓释药物载体

0.1.3牙周组织再生

0.1.4应用前景

0.2牙周病治疗新进展

0.2.1牙周病的病因及其发病机制

0.2.2牙周病的治疗现状

0.2.3牙周局部换控释制剂的研究进展

0.3课题的提出及研究方案

0.3.1研究背景

0.3.2研究内容

0.3.3技术路线

1 CS-HTCC/GP温敏水凝胶的制备及理化性质研究

引言

1.1 HTCC的制备及理化性质研究

1.1.1材料

1.1.2方法

1.1.3结果与讨论

1.2 CS及HTCC对牙周常见致病菌的体外抑菌活性研究

1.2.1材料

1.2.2方法

1.2.3结果

1.2.4讨论

1.3 CS及HTCC的细胞学研究

1.3.1材料

1.3.2方法

1.3.3结果

1.3.4结论

1.4 CS及HTCC的毒理学研究

1.4.1材料

1.4.2方法

1.4.3结果与结论

1.5 CS-HTCC/GP温敏水凝胶的制备及理化性质研究

1.5.1材料

1.5.2方法

1.5.3结果与讨论

1.6小结

2 CS-HTCC/GP温敏水凝胶对牙周常见致病菌的抑制作用

引言

2.1材料

2.2方法

2.2.1厌氧培养基的配置

2.2.2细菌的复苏、培养和标准液的制备

2.2.3最小抑菌浓度的测定（MIC）

2.2.4抑菌环直径的测定

2.2.5统计学处理

2.3结果与讨论

2.3.1最小抑菌浓度（MIC）

2.3.2抑菌环直径测定

2.4讨论

2.5小结

3 CS-HTCC/GP温敏水凝胶的生物相容性评价

引言

3.1细胞相容性

3.1.1材料

3.1.2方法

3.1.3结果与讨论

3.2组织相容性实验

3.2.1材料

3.2.2方法

3.2.3结果与讨论

3.3小结

4 CS-HTCC/GP温敏水凝胶对LPS介导的HPDLCs分泌IL-1β和TNF-α的影响

引言

4.1材料

4.2方法

4.3结果与讨论

4.4小结

5 CS-HTCC/GP温敏水凝胶的毒理学实验

5.1.材料

5.1.1药品与动物

5.1.2仪器与设备

5.2方法

5.2.1急性毒性试验

5.2.2粘膜刺激试验

5.2.3皮肤致敏试验

5.3结果与讨论

5.3.1急性毒性试验

5.3.2粘膜刺激试验

5.3.3皮肤致敏试验

5.4小结

6 CS-HTCC/GP温敏水凝胶促进牙周组织再生的实验研究

引言

6.1材料

6.1.1药品与试剂

6.1.2仪器与设备

6.2方法

6.2.1 CS-HTCC/GP-bFGF温敏水凝胶的制备

6.2.2手术分组

6.2.3手术过程

6.2.4动物处死及取材

6.2.5统计学处理

6.3结果与讨论

6.3.1肉眼观察

6.3.2组织学表现

6.3.3牙周组织学测量结果

6.4小结

7总结与展望

8参考文献

附录

致谢