毛蚶(Scapharca kagoshimensis)血红蛋白的类酚氧化酶活性及其cDNA克隆的研究

摘要

毛蚶(Scapharca kagoshimensis)是隶属于软体动物门瓣鳃纲的一种具有重要经济价值的海洋无脊椎动物，其缺乏真正意义上的抗体、没有免疫记忆能力，只能依靠非特异性免疫反应来抵御寄生虫和疾病，其中血细胞和免疫因子在其对多种病原微生物的免疫防御反应中起着决定性作用。血红蛋白(hemoglobin，Hb)是所有脊椎动物和部分无脊椎动物血液中所含有的一大类含铁的呼吸蛋白，除具有运输氧气的主要功能外，还具有稳定血压、抗菌、运输硫化物、调节酸碱平衡、氧化酶、过氧化酶活性等多种生物学功能，是最具有研究价值的蛋白质家族之一。在其发现无脊椎动物血蓝蛋白具有类酚氧化酶活性之后，本实验室首次发现毛蚶Hb也具有类酚氧化酶活性，从此揭开了毛蚶Hb非特异性免疫功能研究的序幕。本研究拟利用生物化学和分子生物学手段从其血淋巴中分离纯化出毛蚶Hb，鉴定其类酚氧化酶活性(PO-like activity)及其激活因子，确定其生物化学性质和酶性质，查清几种常用免疫促进剂刺激以及细菌感染对毛蚶Hb与血细胞的影响作用，克隆出毛蚶Hb的全长cDNA序列，并利用推测一级结构氨基酸序列进行初步的同源性分析，旨在证实毛蚶Hb的非特异性免疫功能，为揭示毛蚶血红蛋白在动物非特异性免疫中的作用及分子机理，鉴定其在呼吸蛋白家族中的分子进化地位等奠定基础。 本文利用Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析和Q sepharose Fast Flow离子交换柱层析技术成功从毛蚶血淋巴中分离纯化出了血红蛋白，并以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)为特异性底物对其类酚氧化酶活性进行了鉴定，实验结果表明，所得毛蚶Hb纯化样品在SDS-PAGE电泳中为分子量约14.27 kDa的单一条带，胶内酶切肽指纹图谱分析结果证实所得纯化样品确为Hb；同时，所得毛蚶Hb纯化样品对L-DOPA具有很强的氧化活性，且Native-PAGE电泳条带的L-DOPA染色结果也证实其具有很强的氧化活性，表明毛蚶Hb确实具有类酚氧化酶活性。 生化性质和酶性质研究结果表明，毛蚶血红蛋白纯化样品对L-DOPA发挥类酚氧化酶活性的最适pH值为7.0、最适反应温度为30℃，其Km值约为4.90mmol/L，且其类酚氧化酶活性可为异丙醇所进一步激活；不同氧化酶抑制剂的研究结果发现，毛蚶Hb纯化样品的类酚氧化酶活性对苯甲酸非常敏感，对抗坏血酸、亚硫酸钠、柠檬酸和硫脲较为敏感，而对苯硫脲和半胱氨酸不敏感，表明毛蚶Hb发挥类酚氧化酶活性是具有酪氨酸酶类型的酚氧化酶性质；此外，金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)，Zn2+和Cu2+均能强烈抑制毛蚶Hb纯化样品的类酚氧化酶活性，二乙基二硫氨基甲酸酯(DETC)、Ca2+和Mg2+的抑制作用较小，而Fe2+却具有激活作用，说明毛蚶Hb的类酚氧化酶活性还具有金属酶性质；毛蚶Hb纯化样品类酚氧化酶活性的回复实验结果显示，被EDTA抑制的类酚氧化酶活性可特异性地为Fe2+所回复，进一步证明其是一种含铁金属酶性质。综上所述，毛蚶Hb发挥类酚氧化酶活性具有酪氨酸酶类型的含铁酚氧化酶的性质。 免疫促进剂处理毛蚶的实验结果显示，脂多糖、β-葡聚糖、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌处理48 h后，与对照组相比，毛蚶Hb的产量分别增加了7.47％、6.17％、10.39％和27.92％，其类酚氧化酶总活性分别增加了20.72％、4.03％、11.40％和45.84％，而单位酶活性没有显著差异，表明上述四种免疫促进剂的刺激可不同程度地提高毛蚶Hb的合成量及其类酚氧化酶总活性，其中以灭活鳗弧菌的刺激效果最为显著；此外，脂多糖、β-葡聚糖、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌处理48 h后，毛蚶的血细胞的总数分别增加了8.3％、6.3％、2.0％和20.8％，表明上述四种免疫促进剂的刺激可不同程度地增加毛蚶血细胞的数量，其中以灭活鳗弧菌的刺激效果最为显著。综上所述，免疫促进剂脂多糖、β-葡聚糖、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌可可不同程度地增加毛蚶血细胞的数量、提高毛蚶Hb的合成量及其类酚氧化酶总活性，暗示血细胞和血红蛋白的确参与了免疫促进剂刺激下毛蚶自身免疫力的提高。 细菌感染毛蚶的实验结果显示，1×107个/mL，鳗弧菌感染毛蚶48h后，与对照组相比，毛蚶Hb的产量增加了19.78％，类酚氧化酶总活性增加了5.29％，血细胞的总数却减少了37.71％；1x108个/mL哈维氏弧菌感染毛蚶48h后，与对照组相比，毛蚶Hb的产量增加了8.44％，类酚氧化酶总活性增加了6.36％，血细胞的总数却减少了1.75％；而浓度为1×105个/mL的哈维氏弧菌和鳗弧菌感染48h后毛蚶Hb的产量减少了1.99％和7.94％，类酚氧化酶总活性减少了1.15％和5.59％，血细胞数量减少了35.63％和16.67％；上述结果表明，细菌感染能不同程度地引起毛蚶血细胞数量的减少，且高浓度细菌感染可不同程度地引起毛蚶Hb产量和类酚氧化酶总活性的增加，但低浓度细菌感染反而会不同程度地引起毛蚶Hb产量和类酚氧化酶总活性的降低，暗示血细胞和Hb的确参与了毛蚶的非特异性免疫反应。 从毛蚶血细胞中提取总RNA，利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术，分别克隆出了毛蚶血红蛋白HbⅠ、HbⅡ A和HbⅡ B的全长cDNA序列，HbⅠ的cDNA全长为756 bp，编码147个氨基酸残基，分子量为16.2 kDa，与不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)HbⅠ的同源性为99.32％；HbⅡ A的cDNA全长为755 bp，编码150个氨基酸残基，分子量为16.5 kDa，与不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)HbⅡ-A链同源性为98.67％；HbⅡ B的cDNA全长为745 bp，编码152个氨基酸残基，分子量为16.7 kDa，与不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)HbⅡ-B链同源性为99.34％。 研究毛蚶Hb的类酚氧化酶活性，对于揭示Hb在无脊椎动物非特异性免疫中的生物学功能具有重要的理论意义，在动物免疫和呼吸蛋白分子进化等方面也均具有重要的科学价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：本文所用缩写词

声明

第一章无脊椎动物的非特异性免疫文献综述

1无脊椎动物的非特异性免疫系统概述

1.1无脊椎动物对异己的识别机理

1.2无脊椎动物非特异性免疫系统的研究意义

2无脊椎动物血细胞的非特异性免疫功能及其研究进展

2.1无脊椎动物血细胞的分类

2.2甲壳动物血细胞的非特异性免疫功能及其研究进展

2.3贝类动物血细胞的非特异性免疫功能及其研究进展

3无脊椎动物体液免疫分子的非特异性免疫功能及其研究进展

3.1无脊椎动物酚氧化酶的免疫功能及其研究进展

3.2无脊椎动物酚氧化酶原激活系统的研究进展

3.3其它体液免疫因子的非特异性免疫功能及其研究进展

4.动物呼吸蛋白的研究进展

4.1动物呼吸蛋白概述

4.2血蓝蛋白分子结构及其生物学功能的研究进展

4.3血红蛋白分子结构及其生物学功能的研究进展

4.4蚯蚓血红蛋白分子结构及其生物学功能的研究进展

5.无脊椎动物常用的免疫促进剂综述

5.1免疫促进剂的主要类别

5.2免疫促进剂的生物学功能及其作用机理

5.3免疫促进剂的研究价值及其应用前景

6.本文研究的目的与意义

6.1本研究的目的

6.2研究意义

第二章毛蚶血红蛋白的分离纯化及其类酚氧化酶活性鉴定

1.实验用品

1.1实验材料

1.2试剂

1.3仪器设备

1.4几种常用溶液的配方

2实验方法

2.1毛蚶血红蛋白粗品的分离制备

2.2毛蚶血红蛋白的柱层析纯化

2.3 SDS-PAGE电泳

2.4 Native-PAGE电泳

2.5毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的鉴定

2.6 Native-PAGE电泳条带的质谱分析

2.7酚氧化酶活性的测定

2.8蛋白质浓度的测定

2.9四种常用激活剂对血红蛋白转化为类酚氧化酶样酶的激活作用

3.实验结果

3.1毛蚶血红蛋白的分离纯化

3.2各种血红蛋白样品的SDS-PAGE电泳

3.3各种血红蛋白样品的Native-PAGE电泳

3.4各纯化步骤对毛蚶血红蛋白的纯化效率

3.5毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的鉴定

3.6 Native-PAGE电泳条带的质谱分析

3.7四种常用激活剂对血红蛋白转化为类酚氧化酶样酶的激活作用

4.讨论

4.1毛蚶血红蛋白的分离纯化

4.2毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的鉴定

4.3四种常用激活剂对血红蛋白转化为类酚氧化酶样酶的激活作用

5.结论

第三章毛蚶血红蛋白的生物化学性质与酶性质研究

1.实验用品

1.1实验材料

1.2试剂

1.3仪器设备

2实验方法

2.1血红蛋白的酚氧化酶活性测定

2.2不同温度对毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的影响

2.3不同pH对毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的影响

2.4毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的酶动力学曲线测定

2.5不同氧化酶抑制剂对毛蚶血红蛋白纯化样品类酚氧化酶活性的影响

2.6金属螯合剂和金属离子对毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的影响

2.7铁离子对EDTA预处理毛蚶血红蛋白的类酚氧化酶活性的回复作用

3.实验结果

3.1不同温度对毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的影响

3.2不同pH对毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的影响

3.3毛蚶血红蛋白的类酚氧化酶活性的酶动力学曲线

3.4不同氧化酶抑制剂对毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的影响

3.5金属螯合剂和金属离子对毛蚶血红蛋白的类酚氧化酶活性的影响

3.6铁离子对EDTA预处理毛蚶血红蛋白的类酚氧化酶活性回复作用

4.讨论

5.结论

第四章免疫促进剂刺激对毛蚶血红蛋白和血细胞的影响作用研究

1.实验用品

1.1实验材料

1.2试剂

1.3仪器设备

2实验方法

2.1灭活哈维氏弧菌、灭活鳗弧菌悬液的制备

2.2四种免疫促进剂处理毛蚶的方法

2.3免疫促进剂处理后毛蚶血红蛋白样品的制备

2.4毛蚶血细胞的获得

3.实验结果

3.1四种免疫促进剂对毛蚶血红蛋白产量的影响

3.2四种免疫促进剂对毛蚶血红蛋白类酚氧化酶活性的影响

3.3四种免疫促进剂对毛蚶血细胞数量的影响

4.讨论

5.结论

第五章细菌感染对毛蚶血红蛋白和血细胞影响作用的研究

1.实验用品

1.1实验材料

1.2试剂

1.3仪器设备

2实验方法

2.1哈维氏弧菌、鳗弧菌悬液的制备

2.2哈维氏弧菌、鳗弧菌处理毛蚶的方法

2.3处理后毛蚶血红蛋白样品的制备

2.4毛蚶血细胞的获得

3.实验结果

3.1哈维氏弧菌和鳗弧菌对毛蚶血红蛋白产量及其类酚氧化酶活性的影响

3.2哈维氏弧菌和鳗弧菌对毛蚶血细胞数量的影响

4.讨论

5.结论

第六章毛蚶血红蛋白基因的cDNA克隆

1.实验用品

1.1实验材料

1.2主要试剂盒、载体和工具酶

1.3仪器设备

1.4主要试剂配制

1.5 PCR引物

2实验方法

2.1毛蚶血细胞的制备和总RNA的提取

2.2 cDNA第一条链的合成

2.3 cDNA保守序列的PCR扩增

2.4 cDNA扩增

2.5 cDNA全长的PCR扩增

2.6基因组DNA的提取

2.7 cDNA全长的PCR扩增

2.8凝胶电泳中cDNA片段的回收

2.9 DNA片段与克隆载体pMD18-T的连接

2.10大肠杆菌感受态细胞的制备

2.11质粒向大肠杆菌转化(热激法)

2.12 PCR快速鉴定阳性克隆

2.13核酸序列测定

2.14序列分析

3.实验结果

3.1总RNA的获得与鉴定

3.2保守片段cDNA结果

3.3 3’RACE扩增

3.4 5’RACE扩增

3.5毛蚶血红蛋白全长cDNA序列及分析

3.6毛蚶血红蛋白的推测氨基酸序列

3.7毛蚶血红蛋白的同源性分析

3.8毛蚶血红蛋白的分子系统进化分析

3.9毛蚶血红蛋白与酚氧化酶的同源性分析

3.10毛蚶血红蛋白与血蓝蛋白的同源性分析

4.讨论

5.结论

全文总结

主要创新点

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文及专利

致谢