苯并[α]芘对栉孔扇贝生殖毒性效应的研究

摘要

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，简称PAHs)是持久性有机污染物的主要代表，具有内分泌干扰特性。近年来，随着海上石油和轮船运输业的发展以及工业、生活污水的大量排放，海洋环境中PAHs的污染日益加重。但有关PAHs对污染物的指示生物一双壳贝类生殖毒性的研究较少，国内更未见报道。本论文以苯并[α]芘(B[α]P)作为PAHs的代表，研究了B[α]P对栉孔扇贝性腺中激素水平、雌激素受体和卵黄蛋白原的基因表达以及显微结构的影响，并初步探讨了B[α］P对栉孔扇贝的生殖毒性机制，得到了如下结果： 1.苯并[α]芘对栉孔扇贝性腺中睾酮和雌二醇含量的影响 激素对于生物体的生长发育生殖等过程具有重要作用。本实验将栉孔扇贝曝污于不同浓度(0.1μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L)的B[α]P，分别于6d和15d取样，通过放射性试剂盒测定了栉孔扇贝精巢和卵巢中睾酮和雌二醇含量的变化。结果表明，B[α]P能够降低栉孔扇贝性腺中睾酮和雌二醇的含量，除15d时，2.5μg/L B[α]P能够显著降低卵巢中的雌二醇含量(P<0.05)外，其它处理组在6d和15d时对睾酮和雌二醇含量的影响不显著(P>0.05)。本实验表明，B[α]P能够通过降低栉孔扇贝性腺中睾酮和雌二醇的含量而发挥内分泌干扰作用。 2.栉孔扇贝雌激素受体(ER)基因的克隆与序列分析 本实验通过相近物种ER氨基酸序列的同源性比对，根据保守氨基酸序列设计兼并引物，利用RT-PCR以及RACE技术成功克隆了栉孔扇贝ER的完整cDNA序列。将栉孔扇贝的ER与其它物种的ER进行同源性比较发现，ER具有高度保守性，尤其是在DNA结合区(DBD)，栉孔扇贝ER的DBD与牡蛎ER的DBD相似性为98％，与人ERα的DBD相似性为87％，而所选物种间配体结合区(LBD)的保守性相对较低。通过ER的组织特异性研究发现，ER在所选组织中均有表达，且在雌性性腺中表达量较高。 3.栉孔扇贝卵黄蛋白原(VTG)基因的克隆与序列分析 根据NCBI上收录的相近物种的VTG氨基酸序列在线设计兼并引物，通过RT-PCR以及RACE技术成功克隆了栉孔扇贝VTG的部分cDNA序列。将栉孔扇贝的VTG与其他物种的VTG进行同源性比较发现，栉孔扇贝的VTG与同一科物种的VTG具有较高的相似性(78％-89％)，与同一目物种的VTG具有36％-43％的相似性，而与其它无脊椎动物以及卵生脊椎动物VTG的相似性较低，只有21％-33％。通过VTG的组织特异性研究发现，VTG只在栉孔扇贝雌性性腺中表达，说明VTG在栉孔扇贝中也是雌性特异的。 4.苯并[α]芘对栉孔扇贝性腺中ER和VTG基因表达的影响 本实验将栉孔扇贝曝污于不同浓度(0.1μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L)的B[α]P，分别于1d，3d，6d，10d，15d取样，通过半定量RT-PCR技术测定了栉孔扇贝性腺中ER和VTG表达量的变化。结果表明，2.5μg/L B[α]P处理15d时能够显著降低栉孔扇贝卵巢中ER和VTG的基因表达量(P<0.05)；在实验6d时，各处理组栉孔扇贝卵巢中ER和VTG的基因表达量均略微高于对照组水平(P>0.05)，随后又逐渐降低；实验期间，在栉孔扇贝精巢中未检测到VTG的表达且各处理组ER的基因表达量与对照组水平无显著差异。本实验说明B[α]P对栉孔扇贝最终表现出抗雌激素效应，能够通过影响雌激素应答基因的表达而造成生殖毒性。 5.苯并[α］芘对栉孔扇贝性腺显微结构的影响 性腺的质量是繁殖成败的关键。，本实验将栉孔扇贝曝污于2.5μg/L B[α]P处理15d，通过组织学切片研究了B[α]P对栉孔扇贝性腺显微结构的影响。结果表明，B[α]P能够延缓栉孔扇贝的性腺发育，且对卵巢具有损伤作用，表现在滤泡退化，滤泡外缘有与配子重吸收有关的血细胞存在。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1内分泌干扰物的定义、危害及分类

2多环芳烃对海洋生物生殖毒性的研究进展

2.1多环芳烃的来源、分布及危害

2.2多环芳烃的内分泌干扰机制

2.3多环芳烃对海洋生物生殖毒性的研究进展

3本研究的目的和意义

第二章苯并[α]芘对栉孔扇贝性腺中睾酮和雌二醇含量的影响

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验梯度的设置

1.3实验方法

1.4数据处理

2实验结果

2.1 B[α]P对栉孔扇贝精巢中睾酮和雌二醇含量的影响

3讨论

第三章苯并[α]芘对栉孔扇贝性腺中雌激素受体(ER)和卵黄蛋白原(VTG)基因表达的影响

第一节栉孔扇贝雌激素受体(ER)基因的克隆与序列分析

1材料与方法

2结果和讨论

第二节 栉孔扇贝卵黄蛋白原(VTG)基因的克隆与序列分析

1材料与方法

2结果和讨论

第三节苯并[α]芘对栉孔扇贝性腺中ER和VTG基因表达的影响

1材料与方法

2实验结果

3讨论

第四章苯并[α]芘对栉孔扇贝性腺显微结构的影响

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验梯度的设置

1.3光镜样品的制备

2实验结果

3讨论

结论

参考文献

致谢

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