栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒基因组全序列的测定和核酸诊断技术的研究

摘要

栉孔扇贝(Chlamys farreri)作为我国北方沿海特有的优良养殖贝类，形成规模化养殖已有20多年的历史，给我国北方沿海地区带来了巨大的经济效益，在我国海水养殖业中占有重要的地位。自20世纪90年代以来，栉孔扇贝的大规模死亡在我国北方养殖海区连年暴发(累积死亡率高达90％以上)，已给栉孔扇贝养殖业造成了巨大的经济损失，并严重阻碍了这一产业的持续发展。 急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrobiotic Virus，AVNV)，是引起我国北方沿海养殖栉孔扇贝夏季大规模死亡(急性病毒性坏死症)(Acute ViralNecrobiotic Disease，AVND)的病原。该病毒主要在扇贝的消化腺、外套膜、肾脏和肠等的结缔组织细胞和间质细胞中发现，病毒呈球形，直径大小为130～170nm，核衣壳直径为90～140nm，囊膜厚度为5～10nm，外具放射状纤突，纤突长度约为20nm，病毒核衣壳与囊膜间有10～16nm的透明间隙，病毒核心区电子密度较高。这些形态学方面的特征与此前国外报道的感染牡蛎等双壳贝类的牡蛎疱疹病毒(Ostreid Herpesvirus1，OsHV-1)很相似。 首先应用扩增OsHV-1核酸序列的引物(A3/A4、C2/C6和Gp3/Gp4)，以AVNV核酸为模板进行了PCR扩增，得到了部分AVNV的基因序列。序列分析结果显示，AVNV和OsHV-1在A3/A4、C2/C6和Gp3/Gp4片段的核苷酸相似性分别达到了99％、96％和99％，说明AVNV和OsHV-1在核苷酸水平具有很大的相似性。根据这些已有的核苷酸序列和已经公布的OsHV-1的全基因组序列(Gene Bank号为AY509253)设计PCR引物，运用PCR扩增和分子克隆等技术，建立了一系列末端相互重叠的克隆，覆盖整个AVNV的基因组，对这些克隆进行了测序和拼接，完成了AVNV基因组核苷酸序列的测定(GeneBank号：GQ153938)。AVNV基因组全长210，993bp，A和T含量丰富，占61.5％。分析发现，AVNV基因组的两个末端存在较大的反向重复序列(1～7，638和178，052～185，689，187，200～197，411和200，782～210，993)，符合疱疹病毒基因组的基本特征。预测AVNV基因组中含有123个潜在的开放阅读框(Open Reading Frames，ORF)，编码从41个氨基酸残基至1878个氨基酸残基的蛋白质。通过与Gene Bank/EMBL/DDBJ数据库中的核酸和蛋白质序列的同源性分析发现，AVNV中有44个ORF具有一定的结构和功能，且与其它类群的核酸或蛋白质氨基酸序列具有显著的同源性。其功能与病毒DNA复制、核酸代谢、修饰以及病毒与宿主相互作用等有关，如DNA聚合酶(DNA polymerase)(ORF99)、解旋酶SF2 helicase(ORF66)、引物酶(Primase)(ORF24)、ATPase subunit of DNA-packagingterminase(ORF108)、核糖核苷酸还原酶小亚基(Ribonucleotide reductase smallsubunit)(ORF20)、核糖核苷酸还原酶大亚基(Ribonucleotide reductase largesubunit)(ORF50)、dUTP酶(deoxyuridine triphosphatase，dUTPase)(ORF27、ORF33和ORF74)等。对这些主要基因的密码子偏爱性、结构域、同源性和蛋白质二级结构进行了分析，推测了它们可能的功能。分析了AVNV和其它贝类疱疹病毒(主要是OsHV-1)的关系，发现AVNV和OsHV-1的29个ORF编码的蛋白质氨基酸具有100％的同源性，3个具有81～90％的同源性，8个具有40～80％的同源性。对AVNV的分类地位进行了探讨，尽管AVNV和OsHV-1在分子水平的相似程度非常高，二者的亲缘关系很近，但是二者在基因组大小和ORF编码蛋白质的同源性方面存在较大的差异，结合二者在宿主范围、地理分布和流行病学等方面的不同，认为AVNV是疱疹病毒目中Malacoherpesviridae下的一个新种。 在完成AVNV基因组全序列的测定和分析的基础上，针对不同样品分析的要求，建立了AVNV PCR检测方法、巢式PCR检测方法、环介导等温扩增(LAMP)检测方法和荧光实时定量PCR检测方法，为该疾病的快速诊断、致病机理的探讨、分子流行病学调查和传播途径的调查以及预警监测体系的建立提供了重要的技术保障。 PCR检测方法和巢式PCR检测方法，应用Primer premier5.0设计了一步PCR引物和巢式PCR引物，预计扩增产物大小分别为706bp和314bp。对反应条件进行了优化，该两种检测方法的灵敏度分别为100fg和1fg的AVNV核酸，特异性实验表明该两对引物只与AVNV发生阳性反应，和扇贝组织DNA以及其它水生生物病毒均无交叉反应。该方法灵敏度高、特异性好且可以直接对PCR产物进行测序确认，适合在实验室内对大批量样品进行检测。 环介导等温扩增(LAMP)检测方法，应用http：//primerexplorer．jp/e/在线软件PrimerExplorer V4设计LAMP引物，其中包括两对外引物AVNV-F3和AVNV-B3，两对内引物AVNV-FIP和AVNV-BIP(引物AVNV-FIP由F2、TTTT连接子和Flc组成，引物AVNV-BIP由Blc、TTTT连接子和B2组成)。对反应条件进行了优化，当反应混合物在64℃孵育60min时，LAMP方法能用于检测AVNV，最低检测灵敏度达到了1fg的AVNV核酸，而且扩增产物可以通过肉眼直接观察，不需要PCR仪和电泳仪等设备。LAMP是一种操作简单、灵敏度高和特异性好的检测方法，在AVNV的简便、快速检测方面具有重要的应用前景。 荧光实时定量PCR检测方法，根据AVNV基因序列，应用Beacon Designer7.0设计了一对能特异性扩增90bp片段的引物和TaqMan探针，并对反应条件进行了优化。该方法在108～102病毒拷贝范围内有较好的线性关系，AVNV拷贝数(X)和循环数(Ct)的相关关系为：lgX=-0.29Ct+13.28(相关系数R2=0.998)，检测AVNV的最低灵敏度为102病毒拷贝，特异性实验表明只对AVNV基因组呈阳性反应。该方法可以检测到组织中极微量AVNV核酸，且可以进行定量分析，为研究AVNV的动态变化、病毒载量与AVND暴发的相关性、疾病暴发前病毒的危险临界值以及病毒致病机理等方面的研究提供有力的工具。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1栉孔扇贝急性病毒性坏死症的研究进展

1.1.1 AVNV的流行病学及病原学

1.1.2 AVNV导致的组织病理变化

1.1.3 AVNV诊断技术的研究进展

1.2海水贝类病毒病的研究进展

1.2.1 DNA病毒

1.2.2 RNA病毒

1.2.3其它未分类病毒

1.3基于核酸的分子生物学技术在水产动物疾病诊断中的应用

1.3.1核酸探针杂交技术

1.3.2 PCR技术

1.3.3荧光实时定量PCR技术

1.3.4环介导等温扩增技术(LAMP)

1.4疱疹病毒基因组全序列测定的研究进展

1.4.1疱疹病毒基因组全序列的研究进展

1.4.2疱疹病毒基因组结构的特点

1.4.3疱疹病毒分类的新进展

1.5本论文研究目的和意义

第二章栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒基因组全序列的测定和分析

2.1材料和方法

2.1.1 样品采集

2.1.2病毒纯化和DNA提取

2.1.3应用OsHV-1引物扩增AVNV核酸序列

2.1.4扩增AVNV基因组全序列的引物设计策略

2.1.5 AVNV基因组的分段PCR扩增

2.1.6 PCR产物的纯化和连接

2.1.7连接产物的转化

2.1.8插入片段的筛选和鉴定

2.1.9阳性克隆的扩大培养和测序

2.1.10序列拼接和生物信息学分析

2.1.11 AVNV基因组序列号

2.2结果和分析

2.2.1最初获得的AVNV序列分析

2.2.2 AVNV基因组全序列的测定

2.2.3 AVNV重复序列分析

2.2.4 AVNV基因组中潜在的ORF分析

2.2.5 AVNV主要基因的推测以及结构与功能分析

2.2.6密码子的偏爱性分析

2.2.7 AVNV和OsHV-1的比较

2.2.8 AVNV和OsHV-1的关系及其分类地位的探讨

2.3 小结

第三章急性病毒性坏死病毒PCR和巢式PCR检测技术的建立

3.1材料和方法

3.1.1实验材料

3.1.2组织DNA的提取

3.1.3 PCR引物的设计

3.1.4以AVNV-P1/P2为引物的一步PCR反应及条件优化

3.1.5以AVNV-P3/P4为引物的一步PCR反应及条件优化

3.1.6巢式PCR反应及条件优化

3.1.7灵敏度试验

3.1.8特异性试验

3.2结果与分析

3.2.1 AVNV-P1/P2引物检测AVNV的灵敏度

3.2.2.AVNV-P3/P4引物检测AVNV的灵敏度

3.2.3巢式PCR检测AVNV的灵敏度

3.2.4 AVNV-P1/P2和AVNV-P3/P4引物检测AVNV的特异性

3.3讨论

3.4小结

第四章急性病毒性坏死病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测技术的建立

4.1材料和方法

4.1.1实验材料

4.1.2组织DNA及病毒DNA的提取

4.1.3 LAMP引物设计

4.1.4 LAMP检测AVNV方法的建立

4.1.5 LAMP产物的检测

4.1.6 PCR检测AVNV

4.1.7 LAMP检测AVNV的灵敏度实验

4.1.8 LAMP检测AVNV的特异性实验

4.1.9 LAMP检测AVNV的临床应用

4.2结果与分析

4.2.1 LAMP反应条件的优化

4.2.2 LAMP反应产物的检测方法

4.2.3 LAMP方法的灵敏度

4.2.4 LAMP方法的特异性

4.2.5 LAMP检测样品的应用

4.3讨论

4.4小结

第五章急性病毒性坏死病毒的荧光实时定量PCR检测技术的建立

5.1材料和方法

5.1.1样品采集和DNA提取

5.1.2 DNA片段的克隆及质粒标准品的制备

5.1.3 FQ-PCR引物和TaqMan探针设计

5.1.4 FQ-PCR反应条件的优化

5.1.5 FQ-PCR的灵敏度实验及标准曲线的建立

5.1.6 FQ-PCR引物和TaqMan探针的特异性实验

5.1.7 FQ-PCR的重复性实验

5.1.8 FQ-PCR的检测应用

5.2结果与分析

5.2.1质粒标准品的克隆和鉴定

5.2.2 FQ-PCR反应条件的优化

5.2.3 FQ-PCR检测灵敏度的测试及标准曲线的建立

5.2.4 FQ-PCR检测AVNV的特异性

5.2.5 FQ-PCR检测的重复性

5.2.6 FQ-PCR的检测应用

5.3讨论

5.4小结

附录

参考文献

已经完成的文章

致 谢