面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)对中国卤虫(Artemia sinica)抗弧菌感染的影响与酚氧化酶原在卤虫早期发育过程中表达时相的研究

摘要

卤虫又名盐水丰年虫,隶属于节肢动物门,甲壳纲,具有广温、耐高盐等特性,因其营养价值极高,且其休眠卵便于保存,运输等优点成为海水养殖业中非常重要的饵料生物。近年来,在甲壳动物疾病感染机制、生物体抗性反应机制和饵料营养价值分析等方面被作为一种极好的模式生物进行了的相关研究。与其他无脊椎动物类似,卤虫缺乏特异性免疫系统,没有免疫记忆能力,只能依靠非特异性免疫反应来抵御病原菌侵染,其中,由酚氧化酶原激活系统、溶酶体酶(含溶菌酶)和抗氧化酶类(含超氧化物歧化酶)等构成的体液免疫反应,在其免疫防御中发挥着十分重要的作用,其中,酚氧化酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶己被用作评价甲壳动物免疫力的指标之一。
　　 近年来,甲壳动物如虾、蟹等的养殖病害的发生日趋严重,其中,细菌类疾病中由弧菌引起的养殖动物的致死率最高,使养殖业遭受了巨大的经济损失,已成为阻碍水产养殖业健康发展的限制性因素。使用化学药物进行防治的方法,因易造成环境污染、药物残留、危害人体健康等问题,其应用已受到了严格的限制。开拓新的有效的病害防治方法,变得尤为迫切。通过研究甲壳动物的免疫机制,提高甲壳动物免疫力,从而增强其抗病力的途径被认为是解决养殖甲壳动物疾病爆发的关键。
　　 本文比较研究了野生型(WT)面包酵母菌(SC)和其细胞壁同源突变型(mnn9)两种SC酵母菌株作为卤虫饵料,对卤虫抗弧菌VC感染的免疫机制的影响作用。结果发现,分别投喂卤虫WT和mnn9,于培养两天后,两组卤虫的存活率出现显著性差异,同时,对其进行VC侵染实验发现,于侵染24h时,两组之间也出现显著性差异,而且均是投喂mnn9的卤虫明显高于投喂WT的卤虫,随着培养时间的延长,这种差异越来越大。对培养至第三天时投喂WT或mnn9的卤虫体长分别进行了测定发现,投喂mnn9的卤虫体长明显大于投喂WT的卤虫。另外,又对投喂WT和mnn9的卤虫的PO、SOD和LSZ活性变化进行了检测,发现于侵染后不同时间,投喂mnn9的卤虫的三种免疫酶活性均明显高于投喂WT的卤虫。在无弧菌侵染的情况下,得到了与此相一致的结论。分析认为,mnn9相对于WT,对卤虫具有更高的营养价值,并且其细胞壁突变使其成分发生变化,β-葡聚糖及几丁质含量均高于WT酵母菌,因此推测,mnn9首先可以通过营养强化增强卤虫体质,又可以通过细胞壁免疫刺激成份如β-葡聚糖和几丁质形成对卤虫非特异性免疫系统持续有益的刺激,从而提高卤虫的免疫酶活性表达水平,增强其抗VC感染的免疫力,进而提高了存活率。
　　 弧菌VC对卤虫进行侵染后发现,于侵染后24h时,投喂WT的卤虫的存活率明显降低,并随着侵染时间的延长,急剧下降。对其PO、SOD和LSZ活性的检测同样发现,三种免疫酶活性也均于侵染后不同时间出现了显著性下降。说明弧菌VC侵染导致了卤虫先天性免疫系统受损,从而降低了相关的免疫酶活性,引起卤虫存活率降低。
　　 WT或mnn9经热激诱导后,蛋白免疫印迹实验显示其热激蛋白Hsp70的表达量增多,投喂卤虫热激WT后发现,于侵染后48h-72h时,其存活率比投喂正常培养WT的卤虫的明显更高。对其PO、SOD和LSZ三种免疫相关酶活性的检测同样发现,投喂热激WT的卤虫具有更高的酶活性。因此分析认为,酵母菌热激后热激蛋白的增多可能是导致卤虫免疫系统增强的主要因素,通过某种仍然未知的机制,刺激了卤虫的非特异性免疫系统,使其免疫酶活性水平增高,最终提高了卤虫抗感染的能力,使存活率升高。
　　 本文利用已知美国卤虫的酚氧化酶原cDNA序列全长设计引物,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,克隆并拼接获得了中国卤虫proPO的基因序列全长共2125bp,编码699个氨基酸残基,分子量为80.37kDa,等电点为6.48。与美国卤虫的相似性达到99％。对其序列的保守功能结构域进行分析,发现proPO含有一个蛋白酶切位点推测位于Arg75-Gly76,2个铜离子结合位点和一个1个硫羟酸酯结构域。2个铜离子结合位点(CuA和CuB)内含有六个高度保守的组氨酸残基(位于氨基酸225,229,251和379,383,419处)。1个硫羟酸酯结构域(GCGWPEHM)位于氨基酸592-599处,也高度保守。通过分析得知中国卤虫proPO无信号肽序列。对其二级及三级结构的预测发现其铜离子保守结构区为α-螺旋结构。系统进化分析发现,卤虫远离其他十足目甲壳动物,与水蚤形成甲壳动物的另一进化分支。
　　 以卤虫β-actin基因为内参,以获得的proPO基因序列设计特异性引物,利用半定量RT-PCR方法对中国卤虫5个不同发育时期(0h,6h,E(E),Instar Ⅰ和InstarⅡ期)proPO基因的转录表达水平进行了检测,发现卤虫的proPO基因从E期开始出现转录表达,从E期到InstarⅡ期的表达水平没有明显差异。同时对这5个不同发育时期卤虫的PO活性进行了检测,发现只有InstarⅡ期幼虫才有明显的PO活性。说明卤虫proPO转录本与PO酶活性的表达变化在胚胎发育过程中受到了调控。
　　 本文比较研究了弧菌侵染、饵料营养与免疫成分刺激及热激蛋白对卤虫免疫机制的影响作用,对进一步了解目前仍不详细的甲壳动物的免疫机制奠定了一定的理论基础,并为开拓新的增强甲壳动物免疫力的方法如利用免疫刺激物或Hsp的应用等提供了重要的理论依据。并首次对PO在卤虫早期发育中的表达进行研究,为深入了解proPO在体内的表达调控机制及其免疫功能等打下基础,并为免疫防病的研究提供理论基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 卤虫生物学及应用

1.1 卤虫生活史及其形态特征

1.2 卤虫的分类研究

1.3 卤虫的饵料研究

1.4 卤虫在水产养殖中的应用

1.5 卤虫在理论研究中的应用

2 甲壳动物先天性免疫系统及其研究现状

2.1 异己的识别机理-模式识别作用

2.2 屏障作用与滤过作用

2.3 细胞免疫

2.4 体液免疫

3 水产养殖中的病害及其防控方法的研究概况

3.1 水产养殖病害问题

3.2 病害防控方法的研究概况

4 本论文的研究目的与意义

第二章 面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)对卤虫抗弧菌(Vibrio campbellii)感染影响作用的研究

1 实验用品

1.1 实验材料

1.2 试剂

1.3 仪器设备

1.4 几种常用溶液的配方

2 实验方法

2.1 SC酵母菌准备

2.2 弧菌VC准备

2.3 卤虫培养

2.4 卤虫存活率测定实验设计

2.5 SC酵母菌对卤虫生长的影响

2.6 卤虫免疫酶活性测定

2.7 数据分析

3 实验结果

3.1 SC酵母菌生长曲线

3.2 两种SC酵母菌对弧菌VC侵染后卤虫存活率的影响

3.3 两种SC酵母菌对卤虫生长的影响作用

3.4 两种SC酵母菌对弧菌VC侵染后卤虫PO活性的影响

3.5 两种SC酵母菌对弧菌VC侵染后卤虫SOD活性的影响

3.6 两种SC酵母菌对弧菌VC侵染后卤虫LSZ活性的影响

4 讨论

5 本章小结

第三章 面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)热激后对卤虫抗弧菌(Vibrio campbellii)感染影响作用的研究

1 实验用品

1.1 实验材料

1.2 试剂

1.3 仪器设备

1.4 几种常用溶液的配方:

2 实验方法

2.1 SC酵母菌培养

2.2 SC酵母菌热激诱导及其热激蛋白Hsp70的检测

2.3 弧菌VC培养、收获及浓度测定

2.4 卤虫培养

2.5 卤虫存活率测定实验设计

2.6 卤虫免疫酶活性测定

2.7 数据分析

3 实验结果

3.1 SC酵母菌热激处理后Hsp70的表达情况

3.2 热激WT-SC酵母菌对弧菌VC侵染后卤虫存活率及PO、SOD和LSZ活性的影响

3.3 热激mnn9-SC酵母菌对弧菌VC侵染后卤虫存活率及三种免疫相关酶活性的影响

4 讨论

4.1 弧菌侵染对卤虫存活率及PO、SOD和LSZ三种免疫酶活性的影响

4.2 SC酵母菌热激后对卤虫存活率及PO、SOD和LSZ三种免疫酶活性的影响

5 本章小结

第四章 中国卤虫(Artremia sinica)酚氧化酶原基因的克隆、序列分析及其在早期发育中的表达研究

1 实验用品

1.1 实验材料

1.2 实验试剂

1.3 仪器设备

2 实验方法

2.1 卤虫培养

2.2 卤虫总RNA的提取

2.3 引物设计

2.4 RT-PCR

2.5 凝胶电泳中DNA片段的回收

2.6 DNA片段与克隆载体pMD18-T的连接

2.7 质粒向大肠杆菌转化(热激法)

2.8 菌落PCR快速鉴定阳性克隆

2.9 核酸序列测定及序列分析

2.10 中国卤虫proPO转录本在早期胚胎发育过程中的检测

2.11 卤虫PO活性在早期胚胎发育过程中的检测

3 实验结果

3.1 总RNA的获得与鉴定

3.2 中国卤虫proPO两片段cDNA扩增结果

3.3 测序结果及序列分析

3.4 中国卤虫proPO基因及PO活性在早期胚胎发育中的表达

4 讨论

5 本章小结

全文总结

本文主要创新点

论文文献

附录

致谢

个人简历及发表的学术论文