副溶血弧菌tdh、trh和tlh基因的克隆、表达及其基因敲除对其溶血活性的影响

摘要

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是我国海水养殖鱼、虾、贝类的重要病原,每年由此菌引起的弧菌病给养殖业造成严重的损失。VP的主要致病因子是其产生的多种溶血毒素,主要有耐热直接溶血毒素(thenmostable direct hemolysin,TDH),相对耐热直接溶血毒素(TDH-related hemolysin,TRH),不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)。本实验从VP基因组DNA中扩增出tdh、trh和tlh 3个基因,并利用大肠杆菌原核表达系统对其进行了表达,纯化的融合蛋白经复性后具有溶血活性;同时,构建了基因打靶载体的骨架质粒pMO18-T-neo,对3个基因分别进行了基因敲除研究,筛选到三株基因缺失株并对其溶血活性进行了检测,结果表明单独敲除3个基因中的任何一个均不能够影响菌株的溶血活性。具体研究内容和结果如下:
　　 (1)利用PCR技术从VP基因组DNA中扩增出tdh、trh和tlh基因,并成功将3个基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)上,构建了重组表达质粒;经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳证明3个外源基因均发生了表达,表达产物分别为27 kDa、27 kDa和50 kDa的融合蛋白,与推测的理论产物大小一致。经Western blotting鉴定VP抗体能与纯化的TDH、TRH和TLH蛋白发生特异反应,说明3个溶血毒素基因在大肠杆菌原核表达系统中表达是准确的。经溶血活性检测复性蛋白TDH、TRH具有溶血活性,TLH在卵磷脂存在下也出现了溶血现象。
　　 (2)为了正确构建出基因打靶载体的骨架质粒,从真核表达载体pEGFP-N1上扩增出含有自身启动子的新霉素抗性基因(neor)的DNA片段,并将其插入克隆载体pMD18-T中,构建了重组质粒pMD18-T-neo。
　　 (3)克隆打靶载体的长、短臂基因,在tdh,trh和tlh三个基因的同源短臂和同源长臂引物的5'端分别引入酶切位点,以便连入打靶载体。选择两种不同的方法将长、短臂基因连入打靶载体,其一:首先将骨架质粒pMD18-T-neo分别单酶切,接着把用碱性磷酸酶CIAP处理过的骨架质粒与短臂连接,然后按照类似的方法再连入前臂。其二:将骨架质粒pMD18-T-neo双酶切,回收大片段pMD18-T,然后再双酶切小片段neor基因,最后将这两个片段与长、短臂基因用T4DNA连接酶连接。构建好的基因打靶载体线性化后,用电转化方法转入副溶血弧菌中,经新霉素抗性平板筛选,抗性转化子利用PCR鉴定方法筛选tdh,trh和tlh基因缺失株。将tdh、trh和tlh三个基因缺失株接种到5％的兔血琼脂平板上进行溶血性检测,结果这三个基因缺失株在兔血平板上都能够引起溶血,这说明单独敲除副溶血弧菌3个基因中的任何一个均不能够影响菌株的溶血活性,但tlh基因缺失株接种到5％的马血琼脂平板,结果未出现溶血现象,说明砌基因敲除成功。
　　 本实验对副溶血弧菌的3个溶血基因tdh、trh和tlh进行克隆、表达,并用纯化的蛋白制备了多克隆抗体,为在单因子水平上研究副溶血弧菌的毒力、致病机理以及诱导宿主免疫应答方面的作用奠定基础;而且利用同源重组的方法构建了tdh,trh和tlh基因缺失株并进行溶血性检测,探讨溶血作用发生的分子机理,同时也为副溶血弧菌基因组中未知功能基因的的研究提供了一套行之有效的方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略语

1 前言

1.1 副溶血弧菌研究进展

1.1.1 VP的生物学性状

1.1.2 VP的血清分型

1.1.3 VP的基因分型

1.1.4 VP的致病因子

1.1.5 结语

1.2 基因打靶技术

1.2.1 基因打靶的原理

1.2.2 基因打靶的策略

1.2.3 基因打靶的步骤

1.2.4 影响基因打靶效率的因素

1.2.5 基因打靶技术存在的问题

1.2.6 基因打靶技术的应用前景

1.2.7 结语

1.3 本论文研究的目的和意义

1.4 论文的技术路线

2 副溶血弧菌tdh、trh和tlh的克隆、表达及其溶血活性研究

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 主要试剂

2.2.2 菌株与质粒

2.2.3 实验动物

2.3 实验方法

2.3.1 tdh、trh和tlh基因的克隆

2.3.2 原核表达载体的构建及鉴定

2.3.3 tdh、trh和tlh在大肠杆菌中的表达

2.3.4 重组tdh、trh和砌的纯化

2.3.5 多克隆抗体及VP抗体的制备

2.3.6 重组蛋白的Western blotting鉴定

2.3.7 重组蛋白的复性

2.3.8 溶血价的测定

2.3.9 溶血实验

2.4 结果

2.4.1 tdh、trh和tlh基因的克隆

2.4.2 原核表达载体的构建及鉴定

2.4.3 重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

2.4.4 重组蛋白的Western blotting鉴定

2.4.5 溶血活性检测

2.5 讨论

3 副溶血弧菌tdh、trh和tlh基因敲除对其溶血活性的影响

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 菌株与质粒

3.2.2 主要试剂

3.2.3 主要仪器和设备

3.3 实验方法

3.3.1 载体pMD18-T-neo的构建

3.3.2 tdh基因的敲除

3.3.3 trh基因的敲除

3.3.4 tlh基因的敲除

3.4 实验结果

3.4.1 载体pMD18-T-neo的构建

3.4.2 tdh基因的敲除

3.4.3 trh基因的敲除

3.4.4 tlh基因的敲除

3.5 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介