海产品中异尖科线虫生物学检测技术的研究

摘要

蛔目异尖科线虫(anisakid larvae)，是一类广泛分布于海洋动物的寄生虫，人类异尖线虫病是因为食入了含活异尖科第三期幼虫的海鱼和鱿鱼而引起。我国出入境部门相继报道进口鱼类查出该幼虫，并将异尖线虫列为国家禁止入境的二类动物寄生虫。近些年随着生鲜海产品消费量的增多，我国人民感染异尖线虫病的可能性不断加大，海产品中异尖线虫的潜在危害应引起足够的重视。
　　 目前，对于异尖科线虫的检测，主要是水产品加工企业采用灯检方式对海产品中的寄生虫进行在线筛选检测，但更为准确、实用的检测方法则较为缺乏。本论文主要从海产品中异尖线虫的酶消化检测，间接竞争酶联免疫检测，直接竞争酶联免疫检测等方面进行研究，并将建立起来的生物学方法与灯检法进行了比较和验证试验，主要实验结果如下：
　　 1.酶消化检测研究中，确定了酶水解鱼肉的最佳条件为：初始pH值为1.1，温度为37℃，酶活力为8U/mL左右；消化后所得的虫体采用多重PCR方法替代传统的形态学观察进行种属鉴定，从而初步建立了基于酶水解-多重PCR的异尖线虫的酶消化检测体系。实际样本检测表明，该技术可以较为准确、快速地用于海产鱼类中简单异尖线虫(Anisakis simplex)和伪地新线虫(Pseudoterranovadecipiens)的确证性检测。
　　 2.以纯化的鼠多克隆抗体为检测材料，初步建立起海产鱼类中异尖科线虫的间接竞争酶联免疫(Ci-ELISA)检测方法，该方法检测简单异尖线虫检测限为46.9ng/mL，线性范围为60～600ng/mL；检测伪地新线虫检测限为78.7ng/mL，线性范围为100～1500ng/mL。孔间变异系数为6.2％～9.1％，板间变异系数为7.7％～21.0％。以鳕鱼和鲽鱼作为加标样品，在0.5条/100g～2条/100g的加标范围内，该方法检测简单异尖线虫和伪地新线虫回收率约为65.2％～99％，相对标准偏差低于15％。
　　 3.以纯化的兔多克隆抗体为材料，采用过碘酸钠氧化法制备酶标记简单异尖线虫兔多克隆抗体，并且建立起海产品中异尖科线虫的直接竞争酶联免疫(Dc-ELISA)检测方法，该方法检测简单异尖线虫检测限为53.0ng/mL，检测伪地新线虫检测限为60.0ng/mL，线性范围为100～5000ng/mL。孔间变异系数为1.0％～14.2％，板间变异系数为9.6％～19.8％。以蓝点马鲛、鲽鱼和鱿鱼作为加标样品，采用BSA稀释法有效克服了基质效应的干扰，在2条/100g～10条/100g的加标范围内，该方法检测简单异尖线虫和伪地新线虫回收率约为77.8％～107.0％，相对标准偏差低于20％。该方法可以在100min内对海产品中异尖科线虫的特异性筛选检测。
　　 4.分别采用直接竞争ELISA和酶消化方法检测经灯检过的南鳕样本，结果表明，经灯检呈阳性的所有样本采用两种生物学方法检测均呈现阳性。10份灯检呈阴性的样本采用直接竞争ELISA方法检测结果均为阴性，而另外20份灯检呈阴性的样本采用酶消化法检测结果有2份样本检出简单异尖线虫，其余均未检出。
　　 5.综合各种研究结果，分析各种检测方法的特点和适用范围，归纳总结出了海产品中异尖科线虫检测建议性流程。即先将大量的原料采用灯检法进行初步筛选和挑虫，然后再进行免疫学方法的筛选和酶消化法的确证性检测流程。

目录

文摘

英文文摘

谨献

引言

1．异尖科线虫概述

1.1 异尖科线虫的分类

1.2 主要致病性异尖线虫的形态学特征

1.3 异尖科线虫的分布

1.4 异尖科线虫的生活史及人类感染路径

1.5 异尖科线虫的致病机理及对人体的危害

2． 海产品中异尖科线虫检测技术的研究现状

2.1 物理学方法

2.2 消化法

2.3 分子生物学方法

3．异尖科线虫免疫学特性以及免疫学方法的研究现状

3.1 异尖科线虫的抗原组分及其免疫学特性

3.2 免疫学方法在寄生虫检测上的应用

4．本研究的目的与意义

5．本论文的思路和技术路线

第一章 海产鱼类中异尖科线虫酶消化检测技术的研究与应用

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

1.1.2 试验方法

1.2 结果与讨论

1.2.1 pH对于胃蛋白酶水解鱼肉效率的影响

1.2.2 温度对于胃蛋白酶水解鱼肉效率的影响

1.2.3 单位体积消化液酶活力对于胃蛋白酶消化鱼肉效率的影响

1.2.4 单重PCR试验

1.2.5 多重PCR试验

1.2.6 加标检测

1.2.7 实际样品检测

第二章 海产鱼类中异尖科线虫间接竞争酶联免疫(Ci-ELISA)检测方法的初步研究

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 抗体纯化效果的比较

2.2.2 包被抗原及一抗工作浓度的确定

2.2.3 不同基质对于竞争抑制效果的影响

2.2.4 Ci-ELISA方法的评估

2.2.5 加标试验

第三章 海产鱼类中异尖科线虫直接竞争酶联免疫(Direct competitive ELISA)检测方法的研究

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 酶标抗体效价的测定及工作浓度的确定：

3.2.2 最佳反应时间的确定

3.2.3 直接竞争酶联免疫标准曲线的制作

3.2.4 特异性试验

3.2.5 精密度试验

3.2.6 基质效应及其消除

3.2.7 加标试验

第四章 海产鱼类中异尖科线虫不同检测方法之间的比较

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 直接竞争ELISA检测简单异尖线虫虫体抗原的灵敏度

4.2.2 直接竞争ELISA与灯检法检测水产样品中的异尖科线虫的比较

4.2.3 酶消化法与灯检法检测水产样品中的异尖科线虫的比较

4.2.4 海产品中异尖科线虫各检测方法的适用范围及建议检测流程

本文结论与创新点

参考文献

附录 论文中常用的英文缩写及其含义

致谢

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