N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其壳聚糖纳米材料固定化酶抗细菌生物被膜作用研究

摘要

细菌生物被膜是指由细菌和由细菌自身所分泌的包裹着细菌的胞外基质所组成的结构性细菌群落,其中胞外多糖(EPS)作为基质的主要成分之一参与了细菌的初始粘附,成熟的生物被膜结构形成等。研究表明,金黄色葡萄球和表皮葡萄球菌生物被膜中重要多糖成分是β-1,6-N-乙酰氨基葡糖胺。实验室先期研究中发现的β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶Nag1,可以专一降解β-1,6-N-乙酰氨基葡糖胺。本文系统研究了Nag1对革兰氏阳性菌(主要是葡萄球菌)生物被膜形成的作用,并利用羧甲基壳聚糖(carboxymethyl-chitosan,CMCS)纳米材料对酶进行固定化,研究了固定化酶的相关性质。
　　 本实验首先利用多种体外生物被膜模型,包括96孔静态模型、flow cell动态模型,并以临床常用氯乙烯导管、氯乙烯膜片和导尿管为材料构建了相关的模型,评价了Nag1对细菌生物被膜形成的作用。实验表明,在96孔板模型中Nag1对9种葡萄球菌的生物被膜形成均有抑制效果。当Nag1的终浓度为0.3 U/mL时,其对生物被膜形成的抑制率达到80％以上。同样,在flow cell和氯乙烯导管模型中,Nag1也能显著抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。在临床使用的氯乙烯膜片与导尿管等模型中,Nag1对表皮葡萄球菌生物被膜形成的抑制率分别达到76％和72％。
　　 实验进一步表明Nag1对于已形成的细菌生物被膜亦具有明显的清除作用,当Nag1终浓度达到0.3 U/mL时,其对静态模型生物被膜的清除率达到80％以上,而对于动态模型下的生物被膜清除率则达90％以上。Nag1对形成于医用材料氯乙烯膜片与导尿管上的生物被膜清除效果分别为79％和76％。
　　 细菌生物被膜是细菌产生抗药性的物理屏障,为了确定Nag1是否能增强生物被膜内细菌的抗生素敏感性,测定了氨苄青霉素单独以及其与Nag1联合条件下,不同菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)及最低生物被膜清除浓度(minimum biofilm eliminating concentration,MBEC)。结果表明,10株受试菌株形成生物被膜后对氨苄青霉素的抵抗能力有不同程度的提高(16-512倍),Nag1不能改变浮游菌的抗生素敏感性但是可以增强生物被膜菌的氨苄青霉素敏感性(MBEC降低8-64倍)。
　　 为了检测Nag1在动物模型上的作用效果,本实验成功建立了金黄色葡萄球菌小鼠烫伤生物被膜模型并将Nag1作用于感染处,结果显示Nag1可有效抑制并清除感染处的生物被膜。Nag1与抗生素联用可明显提高抗生素的作用效果。
　　 由于溶液酶存在稳定性差、不能反复利用等缺陷,本实验以羧甲基壳聚糖纳米粒为载体,研究了Nag1固定化酶的活力并对影响酶活力的因素包括温度、储存稳定性等进行了检测。实验结果表明,固定化提高了酶的稳定性,同时固定化酶重复操作8次后,仍有63％的活性,表明固定化酶适于酶的回收与反复利用。在细菌生物被膜形成方面,固定化酶对生物被膜的抑制效果和清除效果均优于溶液酶。
　　 实验过程中发现,固定化酶的材料羧甲基壳聚糖本身也具有抗生物被膜效果,因此本文深入研究了羧甲基壳聚糖对生物被膜的影响。在96孔板模型和动态模型下,CMCS可以有效抑制革兰氏阳性和阴性细菌生物被膜的形成。在初始黏附阶段CMCS对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制率均大于90％,而其对生物被膜菌细胞与细胞之间聚集能力的抑制率分别为63％和71％。在作用机制方面CMCS并不能影响细菌生长,而是导致细菌絮凝,其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的絮凝指数分别为17％和25％。进一步分析发现,CMCS对细菌絮凝作用是由于CMCS带有的正电荷中和了细菌表面的负电荷,另外推测CMCS本身的吸附架桥作用也可促进絮凝。
　　 综上所述,Nag1在不同模型中均具有良好的生物被膜形成抑制作用和清除作用;固定化提高了酶的稳定性增强了酶的活力,有利于酶的重复利用;羧甲基壳聚糖自身亦具有良好的抗细菌生物被膜形成作用。以上工作对新型抗生物被膜药物的研究、开发与实际应用具有重要意义。