不同环境海洋放线菌多样性研究及2株放线菌新菌的分类鉴定

摘要

放线菌存在于不同的自然生态环境中,能产生各种各样的次级代谢产物,是一类具有巨大经济价值的微生物。在深海、极地、高盐等特殊环境中存在的放线菌,具有独特的生存机制和生理生化特征,成为人类寻找新型活性化合物的重要来源。因此,对不同环境中的海洋放线菌进行研究,可以进一步认识、开发和利用这些环境中的放线菌资源,具有理论和实践双重意义。
　　 本研究首先比较了不同方法的分离效果,以此为基础,通过纯培养和16SrDNA系统发育分析对黄海冷水团、北极海区及青岛盐池的沉积物样品进行放线菌多样性研究,并对分离菌株进行抗菌活性及胞外酶活性筛选,取得以下结果:
　　 1.海洋放线菌不同分离方法的比较研究:以青岛海区潮间带沉积物为研究对象,分析了不同样品预处理方式、稀释液种类、海水浓度、培养基种类等因素对放线菌分离效果的影响。结果表明:55℃预处理样品6 min能有效地减少其他细菌数量,利于潮间带沉积物中放线菌的分离;以纯海水配制培养基、1/4林格氏溶液稀释样品可以分离到更多的放线菌;不同培养基对沉积物中放线菌的分离效果差别很大,在M1～M9等9种培养基中,以M1、M6、M7和M8培养基的分离效果较好。
　　 2.黄海冷水团沉积物中海洋放线菌的多样性研究:利用4种分离效果较好的培养基从黄海冷水团沉积物中共分离到172株放线菌;选取51株代表菌株进行16S rDNA测序分析,发现这些放线菌分别属于链霉菌属(Streptomyces)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、小单孢菌属(Micromonospora)、异壁放线菌属(Actinoalloteichus)和一个新属,其中Streptomyces属为优势菌属;菌株CXB654与亲缘关系最近的3个细菌标准菌株的同源性分别为96.6％、96.5％和96.1％,可以初步判定该菌株为新的放线菌种属;不同培养基获得的放线菌种类有较大差异,其中培养基M7分离的放线菌种类最多;在172株放线菌中,有58株对病原菌有抑菌活性,有94株可同时产生三种胞外酶活性。
　　 3.北极海洋沉积物中放线菌的分离培养与活性筛选:利用6种培养基(M1～M3、M6～M8)从北极海洋沉积物中共分离出109株放线菌,选取34株代表菌株进行16S rDNA测序分析,结果表明它们分别属于链霉菌属(Streptomyces)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)和拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),其中Streptomyces属为优势菌属;不同培养基获得的放线菌种属数量有较大不同,培养基M7分离得到的放线菌种类和数量较多;在109株放线菌中,有39株对病原菌有抑菌活性。
　　 4.青岛泊子盐场放线菌分离培养:利用3种培养基(M10～M12)从青岛即墨市田横镇泊子盐场盐池底泥样品中共分离纯化出15株放线菌。对分离菌株进行16S rDNA测序分析,发现这15株放线菌分别属于链霉菌属(Streptomyces)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)和一个新属,其中Streptomyces属为优势菌属;菌株CXB832与亲缘关系最近的2个细菌标准菌株的同源性分别为95.4％和94.9％,可以初步判定该菌株为海洋放线菌新属新种。培养基及培养温度对盐池环境中放线菌的分离效果均有影响,利用培养基M11在37℃分离的放线菌种类和数量较多。在15株放线菌中,分别有12株、3株、2株和1株放线菌产淀粉酶、产酯酶、蛋白酶和纤维素酶。
　　 5.耐碱刺孢放线菌新属新种的分类鉴定:菌株CXB654T分离自黄海冷水团沉积物中,该菌基内菌丝有分支,不断裂,气生菌丝分化成长孢子链,孢子呈椭圆形,孢子表面有刺突,生长需要NaCl,核糖和葡萄糖是细胞壁特征糖。16S rDNA序列比对结果显示,菌株CXB654T与Murinocardiopsis flavida DSM45312T、Thermobifida halotolerans YIM90462T、Marinactinospora thermotolerans DSM45154T最为接近,同源性分别为96.6％、96.5％和96.1％,但在N-J和M-L系统进化树上形成独立分支。综合该菌在生理生化特征、16S rDNA同源性和化学指标等方面的实验结果,可以确定CXB654T菌株是拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)中的一个新属,命名为耐碱刺孢放线菌属(Spinactinospora alkalitolerans gen.nov.Sp.nov.)。菌株CXB654T在两个不同国家的菌种保藏中心的保藏号为DSM45414T和LMG25485T。
　　 6.青岛盐生放线菌新属新种的分类鉴定:从青岛泊子盐池中分离出菌株CXB832T,该菌基内菌丝由黄白色到深黄色,有分支,不断裂,丰富的白色气生菌丝分化成长孢子链,孢子呈杆状,孢子表面光滑,最适盐度范围为9～12％(w/v)NaCI,葡萄糖和木糖是细胞壁特征糖。16S rDNA序列比对结果显示,菌株CXB832T与Nocardiopsis arabia DSM45083T和Haloactinospora albus DSM45015T最接近,同源性分别为95.4％和94.9％,并在N-J和M-L系统进化树上形成独立分支。综合该菌在生理生化特征、16S rDNA同源性和化学指标等方面的实验结果,可以确定菌株CXB832T是拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)中的一个新属,命名为青岛盐生放线菌属(Salinactinospora qingdaonensis gen.nov.sp.nov.)。菌株CXB832T在两个不同国家的菌种保藏中心的保藏号为DSM45442T和LMG25567T。
　　 以上研究结果表明,在海洋、极地及盐池等不同环境中存在着丰富的放线菌资源,尤其是新的放线菌,而且这些放线菌具有产生生物活性物质和工业酶的潜力。可以预见,随着研究的不断深入,在这些海洋环境中会发现更多新的放线菌资源和新的活性物质。