土星拟威尔酵母WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的敲除

摘要

一些海洋致病酵母菌能够引起海洋动物的疾病,给海水养殖业造成了巨大的损失。研究表明,嗜杀酵母能够应用于抑制动、植物中病原酵母菌的生长,作为一种有效控制病原酵母菌的方法已经引起了人们的广泛关注。海洋嗜杀酵母Williopsis saturnus WC91-2分离于海底沉积物,具有较广的抗菌谱,对于能够引起梭子蟹“乳化病”的Metschnikowia bicuspidate WCY抑制作用强烈。研究发现该菌株的β-1,3-葡聚糖酶与其产生的嗜杀因子之间存在抑制作用。为了提高该嗜杀酵母菌的嗜杀活性,敲除其β-1,3-葡聚糖酶基因是很有必要的。
　　 将Zeocin基因作为标记基因,构建敲除编码β-1,3-葡聚糖酶基因WsEXG1的敲除载体pMD19-WsEXG1-Zeocin,该敲除载体包含有WsEXG1基因启动子:Zeocin基因:WsEXG1基因终止子的片段,然后将敲除载体转化野生型菌株WC91-2。β-1,3-葡聚糖酶酶活的测定结果显示转化菌株的β-1,3-葡聚糖酶酶活普遍低于野生型菌株的,最低达到0.71U／mL,同时转化菌株的嗜杀活性也普遍增强,抑菌圈直径由野生型菌株的9±0.6mm增大到13±0.5mm。
　　 为了获得WsEXG1基因完全被敲除的纯合子,在一定条件下诱导转化菌株产生子囊孢子并萌发形成子囊孢子菌落。通过对不同子囊孢子菌落β-1,3-葡聚糖酶活性的测定,筛选出酶活最低的一株命名为WC91-2-2,测定其β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.45U／mL,该菌株比野生型菌株产生更多的嗜杀因子。PCR检测显示Zeocin基因插入到W.saturnus WC91-2-2 WsEXG1基因的开放阅读框中。
　　 以葡萄糖作为碳源,采用单次因子方法对敲除菌株摇瓶产嗜杀因子培养基及培养条件进行优化,得到最适产嗜杀因子的培养基组分是(w／v):葡萄糖1.0％,酵母粉3.0％,NaCL浓度0％,培养基初始pH为4.5。最佳培养条件为:在24℃和180 rpm下振荡培养72 h。在此最佳条件下培养,敲除菌株的嗜杀因子最大抑菌圈可以达到19±0.8mm,而WC91-2菌株最大抑菌圈是13±0.6mm,β-1,3-葡聚糖酶的活性也由1.6U／mL降低到0.21U／mL。
　　 本文研究了土星拟威尔酵母在2 L酵罐中产嗜杀因子情况。结果表明:在24℃、通气量为8、转速为250rpm的条件下,发酵36h之内,敲除菌株嗜杀因子产生的抑菌圈直径达到最大值为22±0.8mm。