对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用

摘要

病毒性疾病严重威胁着水产养殖业的健康快速发展。鉴于目前病毒病尚无有效的治疗方法,病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要,因此建立一种多样品、多指标检验并行处理的简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。新兴的抗体芯片技术结合了抗原抗体反应的特异性和芯片高密度集成优势,只需少量生物样品,一次检测便可获得几种甚至几万种有关的生物信息或疾病的检测结果,在人类疾病中病原/疾病标志物等的检测上已显示出广阔的应用前景。但尚未发现有利用抗体芯片法检测水产动物病毒的相关报道。本文将单克隆抗体(单抗)技术、免疫标记技术和抗体芯片技术相结合,以目前水产养殖中的重要病毒病的病原对虾白斑症病毒(White Spot SyndromeVirus,WSSV)和鱼类淋巴囊肿病毒(Lymphoeystis Disease Virus,LCDV)为模式病毒,建立了水产动物病毒检测抗体芯片制备体系,优选了芯片载体,优化了反应条件,研究了点样缓冲液、抗体浓度、固定时间、封闭剂种类和浓度、抗原.抗体反应时间、不同标记显色方法等对芯片灵敏度的影响,制备了对虾WSSV检测抗体芯片和鱼类LCDV检测抗体芯片,并将其用于WSSV/LCDV的检测。具体研究结果如下:
　　 1.针对芯片载体的选择和处理是制备高质量抗体芯片的关键,本文制备了琼脂糖凝胶、丙烯酰胺凝胶、APES、醛基、巯基、多聚赖氨酸修饰玻片,综合分析了以上6种不同修饰的玻片及氨基化玻片、硝酸纤维素(NC)膜、PVDF膜共9种不同载体对抗体的固定效率和效果。结果显示1.2％琼脂糖凝胶修饰玻片表面信号点圆润、均匀,无边缘扩散和拖尾现象,信号值最高,而其他载体都有不同程度的拖尾现象,表明琼脂糖凝胶修饰玻片对抗体的固定能力和固定效果最好。原子力显微镜显示琼脂糖凝胶修饰玻片表面为均匀的三维多孔结构,平均表面粗糙度为18.6 nm,结合琼脂糖凝胶表面经NaIO4活化后的醛基基团,能够以物理吸附和共价结合的方式牢固的固定抗体。因此后续实验采取琼脂糖凝胶修饰玻片作为抗体芯片的载体。
　　 2.以WSSV/LCDV病毒粒子为模式病毒,采用双抗体夹心方式建立了水产动物病毒的抗体芯片检测体系。提纯WSSV/LCDV病毒粒子,制备病毒的兔抗血清,纯化后进行特性分析。结果显示纯化后得到了高活性、高效价的兔抗WSSV及兔抗LCDV抗体,效价分别为1:64000和1:32000。
　　 复苏本研究室前期制备的WSSV/LCDV单抗杂交瘤细胞株,采用腹水生产方法获得大量WSSV/LCDV单抗,辛酸硫酸铵法结合Protein G亲和层析纯化后进行特性分析。结果显示纯化后WSSV/LCDV单抗效价均为1:32000,具很好的活性。采用Cy3抗体标记试剂盒(GE)对纯化后的高效价单抗作Cy3标记,制备了特异性检测WSSV/LCDV的抗体探针,Cy3标记后WSSV/LCDV单抗探针的工作浓度分别为1:2400和1:3000。
　　 3.以制备的兔抗WSSV/LCDV多克隆抗体为捕获抗体,用小型手动芯片点样系统将其点样于优选的琼脂糖凝胶修饰的芯片载体上,制备WSSV/LCDV检测抗体芯片。选用特异性强的Cy3标记的WSSV/LCDV单抗为检测抗体。抗体芯片与WSSV/LCDV病毒稀释液孵育形成复合物,该复合物被Cy3标记的特异性WSSV/LCDV单抗探针识别,经CCD芯片扫描仪读取结果。通过改变芯片制备及应用过程中的具体条件参数,对点样缓冲液、点样抗体浓度、固定时间、封闭剂种类和浓度、洗涤方法、抗原-抗体反应时间、不同标记显色方法进行了优化,得到芯片制备与应用的最佳条件。结果显示,点样用捕获抗体采用含50％甘油的PBS调整到合适浓度(兔抗WSSV抗体为0.1 mg/ml,兔抗LCDV抗体为0.5 mg/ml)进行点样,点样后芯片于37℃饱和湿度固定2 h,3％牛血清白蛋白于37℃饱和湿度封闭1 h,依次用dH2O、PBST、PBST洗涤,每次5 min,甩干后低温密封保存。芯片与捕获抗体的反应时间为15～30 min,检测抗体与芯片上的抗原抗体复合物的反应时间15～30 min,不要超过45 min。
　　 4.研究了不同载体、不同标记物(包括辣根过氧化物酶(HRP),Cy3,异硫氰酸荧光素(FITC),胶体金和生物素)标记单抗用作检测抗体、芯片保存时间等对检测灵敏度的影响。结果显示,以琼脂糖修饰玻片作为载体制备的抗体芯片,分别采用HRP和Cy3标记抗体探针作为检测抗体,检测灵敏度高,WSSV检测抗体芯片的灵敏度分别为0.15μg/ml和0.31μg/ml,LCDV检测抗体芯片的灵敏度均为0.55μg/ml。WSSV浓度在0.62μg/ml-9.9μg/ml范围内,荧光信号强度与病毒浓度的对数值与呈线性关系,相关系数为0.98925;LCDV浓度在0.55-17.56μg/ml范围内,信号强度与病毒浓度的对数值与呈线性关系,相关系数为0.9900。检测信号经生物素-链酶亲和素系统放大之后,灵敏度明显提高,WSSV检测抗体芯片可达25 ng/ml,LCDV检测抗体芯片可达70 ng/ml。
　　 Cy3标记抗体作为检测抗体,抗体芯片于-20℃密封保存4个月后,检测的背景值大幅升高,从而导致相对信号值的下降。HRP标记抗体作为检测抗体,芯片于-20℃下密封保存12个月,WSSV检测抗体芯片的检测灵敏度不变;LCDV检测抗体芯片灵敏度下降至1.1μ/ml。
　　 5.利用建立的抗体芯片技术平台,制备了WSSV检测抗体芯片和LCDV检测抗体芯片。将抗体芯片用于对虾WSSV和鱼类LCDV样品的检测,检测结果与酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosor-bent Assay,ELISA)比较,结果显示WSSV检测抗体芯片与ELISA检测的结果符合率为100％,相关系数为0.9853;LCDV检测抗体芯片与ELISA检测的结果符合率为100％,相关系数为0.9802。说明所制备的抗体芯片能够准确的检测病原,具有很好的特异性与准确性。
　　 6.将抗体芯片技术与免疫酶技术结合,采用HRP标记单抗探针作为检测抗体,制备的WSSV/LCDV检测抗体芯片用于对虾WSSV与鱼类LCDV的现场检测,肉眼即可观察检测结果,解决了抗体芯片结果的读取依赖专用仪器的问题。可视化WSSV/LCDV检测抗体芯片用于病毒现场检测,操作简便,无需昂贵仪器,准确性与IIFA法和ELISA法一致,信号值与病毒浓度的对数值呈线性关系,相关系数分别为0.9505和0.9567,可在一定范围内对病毒进行相对定量检测,在苗种选育、养殖生产的疾病监测中有广阔的应用前景。
　　 本研究所建立的抗体芯片制备体系能够拓展到其它水产动物病原检测领域,是对传统免疫学检测手段的发展。构建的对虾WSSV检测抗体芯片和鱼类LCDV检测抗体芯片,能够对病毒进行准确检测,具微量化、特异性强、方法敏感、样品处理简单和实验条件易于控制等优点,可用于养殖动物WSSV/LCDV的实验室/养殖现场、进出口检疫中的多样品平行检测,具有广阔的应用前景,并为水产动物病原的多样品多病原平行检测提供了有效的技术参考。