藏羚羊微卫星富集文库构建与引物筛选

摘要

本研究利用分子生物学技术进行了藏羚羊微卫星富集文库构建和引物筛选,筛选出一套多态性较高的微卫星分子标记,为探讨藏羚羊种群间基因流以及遗传多样性保持机制奠定了基础。
　　本文通过FIASCO(Fast isolation by AFLP of sequences containingr epeats)法对青海、西藏、新疆三个地理单元的4只藏羚羊DNA样品(青海118号、132号;西藏14号;新疆62号)进行微卫星富集文库的构建与引物开发。将4只藏羚羊的基因组DNA等比例混合,经限制性内切酶MseⅠ酶切获得300-1000bp DNA片段,经接头连接和变性使DNA双链解成单链,使用7种生物素标记的寡核苷酸探针(AG)12、(AC)12、(GC)12、(AT)12、(AAC)8、(TGC)8和(AGT)8与单链DNA片段中含有微卫星的序列进行杂交。根据生物素与链霉亲和素的亲和性原理,用链霉亲和素包被的磁珠亲和捕捉含有微卫星序列的DNA片段。对富集片段通过PCR扩增恢复成双链,纯化PCR产物连接到pCR@2.1载体,DH5α感受态细胞转化培养,通过菌液检测,将条带数等于2的阳性克隆进行测序分析。主要研究结果如下:
　　1、以生物素标记的寡核苷酸探针(AG)12、(AC)12、(TGC)8、(AGT)8、(AAC)8构建的藏羚羊微卫星富集文库,经载体连接和克隆转化,阳性克隆率分别为50.7％、40.7%、50%、41.6%、31.1%,说明构建的藏羚羊基因组微卫星富集文库为质量较好的文库。
　　2、利用磁珠富集法共得到微卫星序列144个,重复次数范围为5-39次。所选择的7种生物素探针中,未富集到(GC)n、(AT)n类型的微卫星序列。
　　3、依据得到的微卫星序列,用Primer5软件在线设计并合成引物107对,对3个地理单元(青海、新疆、西藏)的24个藏羚羊基因组DNA扩增,成功筛选出22个具有多态性的藏羚羊微卫星位点。
　　4、首次构建了藏羚羊基因组微卫星富集文库,并将部分序列提交至GenBank(GenBank Accession Number:KC422272-KC422315)。

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第一章 文献综述

1.1 藏羚羊概述

1.1.1 藏羚羊相关研究

1.1.2 藏羚羊地理分布和种群数量

1.1.3 藏羚羊的生活习性和迁移模式

1.1.4 藏羚羊的经济价值

1.1.5 藏羚羊的保护现状

1.2 微卫星标记技术及其应用

1.2.1 微卫星标记的发现及概念

1.2.2 微卫星的类型及分布

1.2.3 微卫星突变的形成机制

1.2.4 微卫星分离策略

1.2.5 微卫星的生物学功能

1.2.6 其他分子标记技术

1.3 本研究的目的和意义

1.4 技术路线

第二章 藏羚羊微卫星富集文库构建与引物筛选

2.1 材料

2.1.1 样品信息

2.1.2 主要试剂和缓冲液的配制

2.1.3 主要仪器及设备

2.2 方法

2.2.1 Genome DNA 提取

2.2.2 Genome DNA 检测

2.2.3 基因组 DNA 的酶切与接头连接

2.2.4 生物素探针杂交

2.2.5 磁珠富集微卫星序列

2.2.6 含 SSR 的单链 DNA 恢复成双链

2.2.7 载体连接和克隆转化

2.2.8 克隆转化

2.2.9 阳性克隆的 PCR 法筛选

2.2.10 序列整理和引物设计

2.2.11 多态性分析

第三章 实验结果

3.1 微卫星富集文库

3.1.1 基因组提取结果

3.1.2 DNA 的酶切

3.1.3 DNA 片断与接头的连接

3.1.4 磁珠富集

3.1.5 微卫星文库

3.2 阳性克隆的筛选、测序与引物设计

3.2.1 阳性克隆的筛选

3.2.2 阳性克隆测序

3.2.3 引物设计

3.2.4 引物效率的检测

第四章 讨 论

4.1 关于实验方案

4.1.1 非损伤性 DNA 的提取

4.1.2 获得微卫星位点的途径

4.1.3 磁珠富集法优化

4.1.4 探针的选择

4.1.5 PCR 次数的优化

4.2 实验条件分析

4.2.1 样品的采集与保存

4.2.2 PCR 反应条件

4.2.3 电泳

4.3 实验结果的分析

4.3.1 部分基因组文库构建

4.3.2 对文库质量的分析

参考文献

致谢

个人简历