低温超大孔温敏水凝胶的制备、生物相容性及其作为对虾类淋巴细胞3D培养体系的可行性研究

摘要

水凝胶由于其物理性质类似于天然组织而成为生物学和医学领域研究的热点。对水凝胶制备材料的筛选是将其应用于生物材料领域是否成功的关键因素之一。壳聚糖(Chitosan,CS)是一种优良的天然高分子材料,具有无毒性、生物相容性和生物可降解性等优点,随着温敏水凝胶在生物材料领域的发展,CS温敏水凝胶受到广泛的关注。本文以CS和α,β-甘油磷酸钠(α,β-glycerophosphate,α,β-GP)为原料,用物理交联的方法合成了CS-α,β-GP超大孔温敏水凝胶;通过改变CS与α,β-GP的比值考察了其成胶机理;通过改变凝胶制备过程中的各种参数及对该凝胶成胶前后和成胶过程中的性质测定,找出了影响该水凝胶性质的参数和规律,并根据该规律制备出具有低温凝胶性质的的适合海洋动物组织培养的CS-α,β-GP超大孔温敏水凝胶;重点考察了该水凝胶的生物相容性、体内外降解性及其作为对虾类淋巴细胞三维培养体系的可行性。
　　 通过改变制备过程中CS与α,β-GP的比例,制备了一系列在低温下为可流动的溶胶状态,温度升高到一定值时,变为固体的凝胶状态的温敏水凝胶,SEM照片显示该凝胶具有相互连通的超大孔结构。制备过程中CS/α,β-GP比值越大,成胶温度(Tgel)越高。流变学检测结果显示CS-α,β-GP体系在振荡应变为0.1％～100％的范围内具有线性粘弹性。低温下,体系的复合粘度较小,具有良好的注射性能,随着温度的升高,复合粘度迅速增大,可以形成原位凝胶。CS-α,β-GP体系凝胶过程中在600 nm处的吸光度(OD600)经历一个先降低后升高的过程;肉眼观察,在成胶初期为乳白色液体状态,随着时间延长,逐渐变为透明,此时体系仍为流动状态,成胶后又转变为不透明的乳白色。pH值在成胶过程中会有所下降。红外光谱,核磁P谱和热重分析都表明CS与α,β-GP通过离子交联反应生成具有温敏性的CS-α,β-GP水凝胶。
　　 全面的了解CS-α,β-GP温敏水凝胶的性质,有助于我们在此基础上设计符合特定应用要求的水凝胶。为了充分了解制备过程中参数的变化对CS-α,β-GP性质的影响,本论文还研究了除CS与α,β-GP的比值外,包括CS分子量、脱乙酰度、溶液浓度、溶剂的种类和浓度、及体系中混有的无机盐的种类和浓度的改变对CS-α,β-GP温敏水凝胶的性质的影响。结果显示CS的动态粘滞度对CS-α,β-GP温敏水凝胶的pH值、Tgel、成胶时间、及孔径没有明显的影响。CS的脱乙酰度越高,或者CS溶液的浓度越大,制备得到的CS-α,β-GP体系的pH值也越高,Tgel越低,同一温度下的成胶时间也越短,形成的CS-α,β-GP温敏水凝胶的孔径也越小、越均匀。CS溶液的溶剂不同或CS溶液中加入NaCl、CaCl2、MgCl2、KCl,都会对CS-α,β-GP体系的pH值、OD600、Tgel、成胶时间和成胶后扫描电镜下的状态造成一定的影响。CS溶液的溶剂相同时,溶剂浓度越低,CS-α,β-GP体系的pH值越高,4℃条件下OD600越低,Tgel下的OD600越高,Tgel越低,相同温度下的成胶时间也越短。盐的浓度对水凝胶性质的影响以NaCl为例,CS溶液中加入的NaCl的浓度越高,4℃条件下OD600越低,Tgel下的OD600越高,Tgel越高,同一温度下成胶所用的时间越长。
　　 CS-α,β-GP温敏水凝胶在水中和PBS中的平衡溶胀率(Equilibrium SwellingRatio,ESR)受制备过程中CS与α,β-GP比值的影响,比值越大,ESR也越大。溶胀动力学结果表明CS-α,β-GP温敏水凝胶的溶胀过程很快,水分通过对流的方式进入凝胶主体。样品在37℃下的溶胀速度要大于25℃下的溶胀速度,但最终的ESR差别不大。体外酶解实验得出在37℃下,生理pH范围内,CS-α,β-GP温敏水凝胶经胰蛋白酶和溶菌酶降解6 h后,失重率分别达到66.14％和64.26％。CS-α,β-GP温敏水凝胶的胰蛋白酶解动力学和SEM照片表明该凝胶的酶解过程主要是主体溶蚀的过程。
　　 根据前面的实验结果,本论文设计了一种成胶温度为25℃,成胶过程中pH值始终保持在生理范围之内的超大孔CS-α,β-GP温敏水凝胶。通过对几种灭菌方法的比较发现,用紫外线照射的方法对CS粉末灭菌2小时,不仅能达到有效的灭菌效果,还不会影响到CS的性质。
　　 通过小鼠皮下注射实验、急性毒性实验、溶血实验、细胞毒性实验等检测了CS-α,β-GP温敏水凝胶的生物相容性。CS-α,β-GP温敏水凝胶原位注射到小鼠背部皮下后,会迅速的形成两个突起的皮丘。注射后的实验组小鼠全部成活,饮食、活动正常,无发炎现象;在观察期内,体重与对照组相比没有明显的变化,初步说明CS-α,β-GP具有良好的生物相容性。在观察期内的11个取样时间,血液各项指标检测结果都在正常值范围之内。组织学检测表明,CS-α,β-GP温敏水凝胶的组织相容性良好。注射到小鼠体内的CS-α,β-GP温敏水凝胶会随着时间的延长在体内逐渐降解,注射后45 d,凝胶被降解成很多小块,60 d后,凝胶被完全降解。原位注射植入小鼠体内5 d和20 d的CS-α,β-GP温敏水凝胶的SEM照片显示,植入水凝胶周围的细胞紧密贴附在凝胶表面,且随着时间的延长,注射部位的白细胞、纤维细胞能浸润到凝胶的内部,近一步证明CS-α,β-GP温敏水凝胶具有良好的生物相容性。急性毒性实验结果说明CS-α,β-GP温敏水凝胶对小鼠并无明显的毒副作用。红细胞溶血实验结果表明CS-α,β-GP温敏水凝胶材料在浓度为1％的条件下溶血率均低于5％;蛋白吸附实验结果说明该水凝胶与蛋白质的结合属于物理结合,且处在一个较低的吸附水平,证实了其具有良好的血液相容性。MTT检测结果显示,CS-α,β-GP温敏水凝胶样品的提取液没有表现出明显的细胞毒性,MEF的相对增值率在80％以上。CS-α,β-GP温敏水凝胶用DMEM浸泡处理3次(10 min/次)后,MEF细胞的相对增值率达到100％。
　　 以中国对虾(penaeus chinensis)类淋巴细胞为模型,进行CS-α,β-GP温敏凝胶作为对虾细胞三维培养体系的可行性研究,结果发现培养在CS-α,β-GP温敏凝胶表面和包埋在CS-α,β-GP温敏凝胶内部的中国对虾类淋巴组织都会有细胞迁出和生长,且在培养20天后仍然具有很好的活性,传代后仍能生长。
　　 综上所述,本论文通过改变CS与α,β-GP的比例探讨了超大孔CS-α,β-GP温敏水凝胶的成胶机理;研究了影响CS-α,β-GP超大孔温敏水凝胶性质的因素和规律;并根据该规律设计了具有低温凝胶特性的温敏水凝胶,证实了该凝胶具有良好的生物相容性,体内可降解性以及作为对虾细胞三维培养体系的可行性。