新型抗凝血多肽Hirulog-S的合成及质量分析

摘要

Hirulog-S((D)FPRP—GK(Stearic)GG-QGDFEPIPEDAYDE)是本课题组根据比伐卢定缺点和水蛭素Ⅲ型优点而设计的高效新型抗凝血多肽,其中含有一个疏水性的硬脂酸侧链。它与临床药物比伐卢定(Hirulog-1)相比具有显著优点:(1)抗凝活性是比伐卢定的10倍以上,半衰期适中(8小时),高于比伐卢定18倍(半衰期为25分钟),且作用平缓,(2)一天一次或两次静脉注射可保持很高的抗凝活性,用量低于比伐卢定10倍以上,能克服比伐卢定用量大(250 mg／瓶)、半衰期短、连续静脉滴注的缺点。用于预防溶栓后再栓塞,或深静脉血栓形成等,特别适合于PCI手术及与溶栓药共用抗凝。因此,对Hirulog-S质量分析及冻干粉针剂的研究具有非常重要的意义,为其进一步临床应用奠定基础。
　　 本论文在已有工作基础上开展了如下研究:(1)利用手工固相方法,合成了四批Hirulog-S多肽；(2)本论文参考中国药典、相关文献及书籍,建立了适合Hirulog-S原料药的质量分析方法,其质量研究工作包括理化常数测定、鉴别、纯度检验、含量测定及稳定性研究等,并建立起质量标准草案；(3)研究了Hirulog-S冻干粉针剂的配方并对其进行了质量研究和稳定性试验等。
　　 本论文取得的主要结果有:
　　 1.合成硬脂酸修饰的Fmoc-赖氨酸约54.3 g,为Hirulog-S多肽的规模合成提供了氨基酸原料。
　　 2.使用手工固相法合成Hirulog-S多肽(理论分子量2685.37 Da),采用Rink-树脂(取代率0.73 mmol／g)作为固相载体,原料为Fmoc保护的天然氨基酸,20％哌啶作为脱保护剂,HOBT／HBTU／DIEA作缩合剂,缩合完成后进行裂解得到目标产物。共合成四批,每批规模分别为5、10、10、20 mmol,粗产量分别为9.36、15.40、22.60和42.92 g,粗产率的平均值为73％。经高效液相纯化,目前已得到13.8 g。
　　 3.原料药的质量分析
　　 (1)通过对Hirulog-S多肽的氨基酸组成分析,序列测定及质谱鉴定表明它的一级结构与理论计算相符,比旋度结果表明此肽为左旋性药物。
　　 (2)通过不同色谱柱的等度沈脱和梯度探索,获得Hirulog-S分析的较理想的洗脱梯度(HPLC)。在25.4～508μg／mL范围内,以峰面积(Y)为纵坐标,样品浓度(X)为横坐标,进行线性回归,方程为:Y=19.289 X-175.08,R2=0.9990,峰面积与浓度线性关系良好。测定Hirulog-S样品中的含量及有关物质,结果三批样品(批号20100301,20100302,20100303)含量分别是99.7％±1.3％,100.4％±1.1％,99.4％±0.96％,总有关物质分别在0.59％～0.97％之间。
　　 (3)采用卡尔菲休库仑滴定法准确测定了三批样品及对照品(批号:20100304)中的水分含量。所得的结果分别为2.3％±0.05％,2.1％±0.06％,2.1％±0.11％,2.3％±0.12％,批次之间水分含量均匀。
　　 (4)采用RP-HPLC方法,进行本品中TFA含量的测定,结果分别为12.08％±0.15％,9.08％±0.14％,12.76％±0.21％,10.93％±0.08％。
　　 (5)使用硫代乙酰胺法和古蔡氏法测定重金属(Ag、Pb和As)含量均小于10 ppm,符合药物申报要求。
　　 (6)用色谱法进行了Hirulog-S稳定性试验,结果表明Hirulog—S在一定的环境下是稳定的。
　　 4.冻干粉针剂的配方研究及质量分析
　　 (1)通过筛选获得了Hirulog-S的冻干粉针剂的配方为:每瓶25 mg多肽,12.5 mg甘露醇,用0.5 M的碳酸钠调节pH为8左右,冻干得白色粉末。
　　 (2)对Hirulog—S冻干粉进行了质量分析以及稳定性研究。
　　 5.在质量研究的基础上,制订了Hirulog-S原料药质量标准草案,经检验,该标准能有效地控制产品的质量。