长期以来，炎症一直被认为和癌症密切相关，因为反复发生的慢性炎症和感染大大提高了肿瘤的发病率，但其中的具体分子机制仍未得到详细阐述。近年来随着研究的深入，逐渐认识到IκB激酶(Inhibitor of kappa B Kinase，IKK)复合物和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)在慢性炎症导致癌症发生过程中的重要作用。肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα，TNFα)等配体的刺激下，IKKβ磷酸化IκBα(inhibitor of NF-κB)分子并诱导其降解，使NF-κB从IκBα-NF-κB复合体中解离后转运至细胞核启动下游基因的转录，调节肿瘤相关癌基因与抑癌基因的表达。而且IKKβ主要通过刺激炎症因子的分泌在连接炎症与肿瘤之间的桥梁中发挥关键作用，IKKβ过表达或活性增加可以有效刺激炎症因子的分泌，如TNFα，IL-1，IL-6，IL-8，CSF-1和COX2等。炎症因子通过调节肿瘤细胞和间质细胞之间以及肿瘤细胞和细胞外基质之间的相互作用，改变了肿瘤细胞的生存微环境，内源性地促进肿瘤的生长、浸润、扩散。作为多条信号通路的中心节点，mTOR通路通过广泛的网络效应影响肿瘤的生长和增殖。生长因子、有丝分裂原、能量、营养物质、细胞内压力都通过对抑癌基因TSC1和TSC2的翻译后修饰调控mTOR的活性；还有很多激酶，如Akt、Rsk1、Erk、Gsk、Cdk1、p38、Mk2和AMPK，都能作为TSC(Tuberoussclerosis protein)的激酶，调节TSC1/TSC2/mTOR通路，进而转导胞外信号和介导肿瘤生成。尤为重要的是，炎性因子在其中也发挥着重要作用，如肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)分泌的TNFα、IL-1β可以通过mTOR介导的VEGF等细胞因子的表达促进肿瘤生成。另外，活化后的IKKβ还能磷酸化TSC1，改变TSC1的膜定位，阻碍其与TSC2之间的结合，消除TSC1-TSC2复合物对mTOR的抑制作用，进而激活mTOR通路并促进下游VEGF表达。因此炎症因子TNFα能够激活mTOR通路，并且通过IKKβ介导的对TSC1的抑制作用促进肿瘤血管生成。所以，IKKβ和mTOR通路在炎症与肿瘤之间搭建了一座桥梁，二者的作用不仅在一定程度上解释了慢性炎症和感染引发肿瘤的原因，更重要的是它们可作为预防和治疗肿瘤潜在的新靶标，大大推进抗炎抗肿瘤药物的开发。因为与传统单纯以肿瘤细胞为靶点的治疗方法相比，同时针对肿瘤细胞和炎症细胞的治疗方法不仅疗效显著提高，而且不易形成耐药性，因为炎症细胞的基因组相对稳定，大大增加了药物治疗的特异性。 本文以此作为出发点，利用分子生物学方法分别采用大肠杆菌原核表达系统和昆虫杆状病毒表达系统，进行IKKβ和mTOR外源蛋白表达，并对两种表达体系产物的活性进行比较。最终采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，分别构建IKKβ全长和mTOR激酶区截断突变体mTOR-FKD的Bac-to-Bac供体质粒和穿梭质粒，通过杆状病毒感染昆虫细胞表达具有组氨酸标签的IKKβ和mTOR-FKD重组蛋白，经过亲和层析得到纯度较高、活性较好的目的蛋白。以激酶与底物及ATP的体外反应为基础，采用固定变量法，逐一对激酶反应体系中ATP、底物和激酶的浓度进行优化，并使用阳性抑制剂对筛选模型予以评价，确保筛选模型的稳定、灵敏。使用基于生物发光原理的Kinase-GloLuminescent Kinase Assay分析方法，采用均质荧光素酶体系进行检测，拟建立分子水平的丝/苏氨酸蛋白激酶IKKβ和mTOR抑制剂筛选模型，为将来寻找特异性的靶向该激酶的抑制剂提供有效的工具。
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