栉孔扇贝(Chlamys farreri)颗粒血细胞发生及其单克隆抗体与五种双壳贝类血细胞交叉反应的研究

摘要

本论文从栉孔扇贝(Chlamys farreri)血细胞单克隆抗体库中筛选出一株能够特异性识别栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体,用其作为颗粒血细胞示踪分子探针,揭示了栉孔扇贝颗粒血细胞的发生时间与分布特点,检测了栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体与五种双壳贝类血细胞的交叉反应情况,旨在为贝类血细胞的发生、分化和免疫功能研究积累资料。本论文主要包括以下三部分:
　　1栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的特性分析分别应用间接免疫荧光法、流式免疫荧光法、免疫电镜法和免疫组化法,从栉孔扇贝血细胞单克隆抗体库中筛选出一株特异性较强的单克隆抗体(单抗)6C6。间接免疫荧光检测发现,单抗6C6能特异性的与栉孔扇贝颗粒血细胞结合,并且其反应为强阳性;流式免疫荧光检测发现,单抗6C6的阳性率为59±2.4％,其中阳性透明血细胞(PH)占6±2.3％,阳性颗粒血细胞(PG)占53±2.5％,阳性颗粒血细胞占总阳性血细胞数的89±2.4％:免疫电镜检测发现,胶体金粒子基本呈点状密集分布在颗粒血细胞的胞质颗粒上;免疫组化检测发现,单抗6C6能特异性识别扇贝组织中的颗粒血细胞,并且与其它组织细胞没有交叉反应。以上结果表明:单抗6C6可以作为定位栉孔扇贝颗粒血细胞的特异性分子探针,可以为颗粒血细胞的发生与分布、血细胞免疫功能等研究提供工具。
　　2栉孔扇贝颗粒血细胞的发生与分布分别应用光镜微分干涉观察、半薄切片H&E染色法和单克隆抗体的免疫组化法,通过栉孔扇贝不同时期幼虫(担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫和匍匐幼虫)的免疫组化研究发现,栉孔扇贝颗粒血细胞最早出现在D形幼虫期,颗粒血细胞为球形或椭球形,直径为3～5μm,分布于D形幼虫的面盘基部、消化腺内、胃壁和消化道壁周围:栉孔扇贝壳项幼虫外套膜组织内的颗粒血细胞散在分布,面盘顶部与食道附近有少量游离颗粒血细胞的存在,面盘基部、消化腺内及胃的周围颗粒血细胞数量多,相互聚集成簇;栉孔扇贝匍匐幼虫的外套膜、鳃、消化腺内及消化道、胃周围等组织器官广泛分布着大量颗粒血细胞,直径为4～6μm,颗粒血细胞数量多,形态多样。以上结果表明:栉孔扇贝颗粒血细胞最早出现在D形幼虫期,颗粒血细胞分布于幼虫的面盘基部、消化腺内、胃壁和消化道壁周围等与摄食、运输和消化功能相关的组织器官中,可以推测颗粒血细胞的这种分布特点与扇贝早期幼虫不完善的免疫防御系统有关。
　　3栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体与五种双壳贝类血细胞的交叉反应分别应用斑点印迹法、间接免疫荧光法和流式免疫荧光法,研究栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体与五种双壳贝类,包括海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎、紫贻贝和毛蚶血细胞的交叉反应情况。斑点印迹法检测发现,单抗6C6与海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎血细胞反应为阳性,与紫贻贝、毛蚶血细胞为阴性反应;间接免疫荧光检测发现,单抗6C6可以和海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎颗粒血细胞发生特异性的结合,呈现阳性反应,但与这三种贝类的透明血细胞以及紫贻贝、毛蚶血细胞未发生特异性结合;流式免疫荧光检测发现,单抗6C6能特异性识别海湾扇贝、虾夷扇贝和太平洋牡蛎的颗粒血细胞,其阳性率分别为为15±2.5％,12±2.1％,19±2.1％。以上结果表明:栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体与海湾扇贝、虾夷扇贝和太平洋牡蛎颗粒血细胞存在交叉反应现象,说明这几种双壳贝类颗粒血细胞的膜蛋白含有共同的抗原决定簇,进而推测其亲缘关系较近。