草鱼(Ctenopharyngodon idella)对亚硝酸氮、氨氮和温度胁迫的生理响应

摘要

草鱼是我国国内广泛养殖的一种淡水鱼类,但是在养殖过程常常会面对多种多样的环境胁迫而产生应激反应。本研究通过在亚硝酸盐,氨氮和温度胁迫下草鱼几种应激反应相关基因的表达,初步探讨了环境胁迫下草鱼的生理响应。
　　1.亚硝酸盐胁迫对于草鱼(Ctenopharyngodon idella)sod和hsp90基因表达的影响
　　在草鱼的养殖生产中,由于精养和工厂化养殖的扩大,水体中常含有较高浓度的亚硝酸盐。本实验通过测定草鱼的24 h半致死浓度,sod和hsp90的表达模式研究了草鱼在分子生物学水平上对高浓度亚硝酸盐暴露的响应。经过半致死实验确定的亚硝酸盐24 h LC50为445 mg/L。实验中草鱼被置于5个浓度的处理组中(50,87,151,263,400 mg/L),取肝脏,肠和鳃来测定sod和hsp90的表达情况。经过高浓度的亚硝酸盐暴露处理,sod和hsp90的表达受到了显著的上调,但是在不同组织中的表达模式不同。这些结果指出,高浓度的亚硝酸盐能够诱导应激蛋白的表达,并且sod和hsp90可以作为评估草鱼氨氮暴露水平的良好指标。2.急性氨氮胁迫对于草鱼(Ctenopharyngodon idella)sod和hsp90基因表达及鳃部结构的影响
　　本实验通过测定草鱼的24 h半致死浓度,鳃的细胞结构以及sod和hsp90的表达模式研究了草鱼在组织学和分子生物学水平上对高浓度氨氮暴露的响应。经过半致死实验确定的氨氮24 h LC50为243 mg/L试验中草鱼被置于5个浓度的处理组中(50,72,104,151,220 mg/L),之后取鳃组织进行组织切片分析,取肝脏,肠和鳃来测定sod和hsp90的表达情况。经过高浓度的氨氮暴露处理,鳃组织的细胞排列和结构产生了明显的变化,并且sod和hsp90的表达受到了显著的上调,这些结果指出,高浓度的氨氮能够损害鳃部的细胞结构并且诱导应激蛋白的表达。这个结果同样显示出,sod和hsp90可以作为评估草鱼氨氮暴露水平的良好指标。
　　3.草鱼(Ctenopharyngodon idella)hsp70和hsp90对温度急性变化的响应
　　在夏季苗种运输及养成期间,高温会诱发草鱼(Ctenopharyngodon idella)产生疾病,导致大规模死亡,因此研究高温胁迫对草鱼生理影响具有重要意义。热休克蛋白的诱导表达是生物抵御温度胁迫的重要机制。结合耗氧率和死亡率数据,研究不同对温度条件下热休克蛋白的表达模式可了解草鱼对温度的耐受和适应机理。在本研究中,为分析草鱼热休克蛋白(hsp7D和hsp90)对急性温度变化的响应,将在20℃下驯化的草鱼在7个实验温度(22,24,26,28,30,32,34℃)中热激3 h,然后20℃恢复2 h,取肝脏,肌肉和鳃测定hsp70和hsp90表达。结果表明,hsp70和hsp90表达量随着温度升高而上升,当温度达到34℃时,肌肉与鳃热休克蛋白表达量显著下降。结合以往草鱼耗氧率和死亡率数据进行分析,发现草鱼耗氧率、热休克蛋白表达和死亡率之间的关系符合氧限制热耐受理论(OCLTT),证明了OCLTT理论在淡水广温性鱼类中的适用性。基于OCLTT理论,草鱼生理临界温度为～28℃,当温度超过28℃,热休克蛋白表达所需能量主要由无氧代谢提供,进而导致体内氧自由基增加,影响免疫应答,造成草鱼大规模患病和死亡。因此在夏季运输过程中,应避免将草鱼暴露于长期高温(＞28℃3h以上)中。
　　4.鲤鱼(Cyprinus carpio)hsp70基因的克隆及序列分析
　　根据GenBank中己提交的鱼类hsp70序列保守区域设计简并引物得到核心片段,通过RACE技术获得3'及5'末端,经拼接后得到鲤鱼hsp70 cDNA全长2303 bp,ORF为1932 bp,还包括137 bp的5'UTR,234 bp的3'UTR。编码643个氨基酸,预测相对分子量为70.5 kDa,理论等电点为5.42,包含Hsp70家族3个签名序列。不同组织中半定量表达实验结果表明,在暂养条件下,在各组织中均有表达且无显著差异。通过克隆鲤鱼hsp70基因,对深入研究鲤鱼对环境胁迫的响应机制以及与草鱼等其他鱼类在生理适应上的差别具有重要意义。