花生(Arachis hypogaea L.)NBS类抗病基因的克隆及黄曲霉侵染对花生的影响

摘要

花生是世界四大油料作物之一，我国花生产量占世界花生总产量的45％。因黄曲霉侵染而使黄曲霉毒素含量超标，是我国花生出口的一个重要限制因素，因此提高花生品种抗性、选育抗黄曲霉品种成为热点问题。NBS类抗病基因是植物抗病基因中一个最大的类别，NBS结构域可能结合了抗病信号的传递，在植物抗病反应中发挥重要作用。本研究通过同源序列克隆技术结合RACE技术，从花生中克隆得到一条NBS类抗病基因，并对其功能进行初探，为花生黄曲霉抗性品种的选育奠定基础；同时通过对不同品种花生种子黄曲霉侵染后产毒情况及侵染不同时间花生品质变化的检测，研究黄曲霉侵染对花生的危害。
　　 根据NBS保守结构域设计简并引物，从花生中克隆得到一条539bp的NBS类抗病基因片段，命名为PnAG3。采用RACE技术手段分离克隆PnAG3基因全长。PnAG3基因的全长1876bp，开放阅读框1335bp，多序列比对结果显示PnAG3基因与已知的抗病基因具有一定的相似性，其中与Arachis cardenasii抗白蛋白抗基因具有最高的同源性(48.01％)。序列分析表明，PnAG3基因具有NBS结构域的大部分保守结构域，如P-loop，Kinase-2，Kinase-3a，GLPL和RNBS-C等。
　　 根据PnAG3基因序列和DF-actin管家基因序列，设计实时荧光定量PCR引物，构建了pMD18-T-PnAG3和pMD18-T-Actin重组质粒，成功建立了能精确分析花生PnAG3基因表达水平的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法。利用该方法分析了PnAG3基因在两不同花生品种的种皮及籽仁中的表达量随时间变化情况，发现PnAG3基因可能与花生抗旱性或黄曲霉抗性密切相关。
　　 利用荧光定量PCR技术，分析在不同程度干旱胁迫下PnAG3基因在不同花生品种中表达量变化情况，并结合抗氧化酶体系活力变化情况分析PnAG3基因与花生抗旱性的关系。结果表明，黄曲霉抗性品种在中度干旱胁迫下SOD、POD和CAT活力升高幅度最大，分别升高了3.15倍、2.55倍和4.95倍，而黄曲霉敏感性品种在三种处理下差异不显著；MDA含量在不同干旱程度下均有所升高，且敏感性品种升高幅度大于抗性品种；基因PnAG3的表达量在抗性品种中要高于敏感性品种。结合耐旱生理指标及抗病相关基因PnAG3的变化情况，表明PnAG3基因表达量变化与耐旱生理指标变化有相关性，且在抗性品种中PnAG3基因的表达量大于敏感性品种，因此推测PnAG3基因的功能与花生抗旱性有关。
　　 黄曲霉田间侵染前后，检测PnAG3基因在不同花生品种中表达量变化情况及花生品质变化情况，分析PnAG3基因与花生黄曲霉抗性的关系。结果表明，黄曲霉侵染后，在黄曲霉抗性品种J11中，PnAG3基因的表达量在果皮、种皮和籽仁中分别增加了25.96倍、16.68倍和11.16倍。而在黄曲霉感病品种JH1012中，PnAG3基因的表达量只增加了2-3倍。因此推测PnAG3基因的功能可能与花生黄曲霉抗性显著相关。在黄曲霉侵染后，不同花生品种的果实品质发生变化，且产量都有不同程度的减少。
　　 另外，本研究采用一定浓度的黄曲霉孢子悬液侵染花生种子，测定了花生种子中黄曲霉毒素含量随时间的变化情况，同时测定了花生品质变化。结果发现，黄曲霉侵染花生的部位主要为花生种皮，且黄曲霉毒素含量随着侵染时间增加而增加。不同花生品种中毒素含量为：品种JH1012＞HY22>J11。同时花生中亚油酸、油酸及脂肪含量均有不同程度的变化。