青岛文昌鱼一种清道夫受体基因的鉴定、进化和功能研究

摘要

B类清道夫受体(the class B scavenger receptor，SR-B)是一种位于细胞表面的跨膜糖蛋白，主要包括SR-BⅠ、SR-BⅡ和CD36。SRB可与多种配基结合，其在细胞和组织中分布也较为广泛，参与很多生理和病理过程，如机体免疫防御、凋亡细胞清除、动脉粥样硬化及其它心血管疾病等。目前在很多物种中SR-B基因的序列、结构、表达和功能已经得到了比较深入的研究。而在文昌鱼中的研究却一直未见报道。文昌鱼是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。本文克隆了青岛文昌鱼(Branchiostomajaponicum)的具有完整开放阅读框的SR-B同源基因(BjCD36)，并对其进化、表达和功能进行了研究。主要研究结果如下：
　　 第一，我们对青岛文昌鱼中的SR-B基因进行了鉴定。在弗罗里达文昌鱼中我们发现了五个SR-B的同源基因(SRB-a，b，c，d，e)它们编码的氨基酸序列长度分别是480aa、445 aa、912aa、229 aa、159 aa，但是通过NCBI上保守的结构域分析发现只有三个基因(SRB-a，b，c)编码的蛋白质有完整的CD36结构域。最后通过多序列比对发现，SRB-a与SR-B的相似度与其他四个相比更高，并且SRB-a与CD36的相似度比它与SR-BⅠ/Ⅱ的相似度要高，另外，通过基因结构分析发现，SRB-a基因的基因结构与脊椎动物尤其是斑马鱼的极为相似。所以我们首先将SRB-a基因确定为我们在青岛文昌鱼中的研究对象。此外，我们对脊椎动物CD36基因的基因结构、内含子类型和在染色体上的位置等进行了分析，结果显示CD36基因在脊椎动物中高度保守，暗示CD36基因的功能在进化过程中可能具有保守性。
　　 第二，我们在青岛文昌鱼中通过RACE-PCR技术克隆了SRB-a(本文命名为BjCD36)并对其序列进行了分析。BjCD36全长1711 bp，开放阅读框(ORF)含有1482 bp，编码494个氨基酸的蛋白质。并且通过多序列比对发现该序列与弗罗里达文昌鱼中SRB-a基因的氨基酸序列之间的相似性高达90％。
　　 第三，我们对BjCD36基因在文昌鱼中的组织和胚胎发育中的时空表达情况做了研究。Real-time PCR和切片原位杂交结果显示，BjCD36在成体组织的肝盲囊中表达量最高，在其他组织中的表达相对要低。胚胎原位杂交显示，BjCD36在早期胚胎及一天幼虫中都有表达，在两天幼虫中是在幼虫的前三分之一处表达，表明该基因可能在胚胎发育中发挥重要作用。
　　 第四，为了研究BjCD36基因是否有免疫相关功能，我们用大肠杆菌处理文昌鱼，发现大肠杆菌感染后BjCD36的表达上调。此外，我们用不同浓度的LTA处理转染了BjCD36的牙蚜鲆鳃细胞系(FG)，结果发现10μg/ml或20μg/ml的LTA都能诱导BjCD36上调表达。体内和体外实验都证明了BjCD36是与免疫相关的基因，参与到机体免疫过程。为了研究BjCD36是否是与摄食调控相关，我们对文昌鱼先喂食，接着进行饥饿处理，发现在喂食后2 h鳃中BiCD36的表达显著升高，随后随着饥饿时间的延长，BjCD36的表达逐渐降低，表明BjCD36基因确实是参与到了文昌鱼的摄食调控过程中。由此，我们证明BjCD36参与免疫与摄食调控，与高等脊椎动物CD36基因具有功能上的保守性。