条斑紫菜(Pyropia/Porphyra yezoensis)实时荧光定量PCR内参基的筛选

摘要

实时荧光定量PCR是研究基因表达的一项有效的技术，但是要准确的反应基因表达状况，需要表达稳定的管家基因作为内参基因。条斑紫菜是潮间带藻类的代表性模式物种，随着潮汐作用，条斑紫菜要周期性的经历海水和空气两种截然相反的环境条件的变化，低潮时会面临诸多的环境因子剧烈变化的胁迫；同时条斑紫菜生活史为异型世代交替，存在叶状体和丝状体两种形态差异显著的世代，是研究大型藻类抗逆性机制及世代发育的良好材料。加强对条斑紫菜内参基因的筛选，将为研究相关基因的表达规律、揭示条斑紫菜的生物学特性奠定基础。
　　 本研究对条斑紫菜进行了不同的胁迫处理，包括温度变化处理、光照变化处理、失水处理三种。选取了肌动蛋白(ACT3)、泛素结合蛋白(UBC)、3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)、翻译起始因子(eIF4A)、延伸因子(EF)、a微管蛋白(TUA)六个常用的管家基因作为候选基因，通过实时荧光定量PCR技术检测这6个基因在不同环境因子及发育世代下的表达稳定性，利用NormFinder、GeNorm、Best-keeper等软件筛选表达最稳定的基因。
　　 Best-keeper分析表明，在不同处理条件胁迫处理的样品中，ACT3、eIF4A、EF适合于单独内参或多个内参的选择，GAPDH适合于单独内参的选择。在不同的发育时期eIF4A、EF适合于单独内参或多个内参的选择，UBC适合于单独内参的选择。
　　 NormFinder软件分析表明，在不同的胁迫处理条件下，表达最稳定的是ACT3，其次为eIF4A和EF；而在不同的发育时期，表达最稳定的是UBC，其次为EF及GAPDH；在以上两种情况下，TUA都是表达最不稳定的，不适合作为内参基因。
　　 GeNorm软件分析表明，不管是在不同的处理条件胁迫还是不同的发育时期，eIF4A和EF是合适的一对内参基因，这与前两个软件的分析相吻合。
　　 综合三个软件的分析，若使用单一内参基因，在研究条斑紫菜不同发育时期的基因表达情况时，选择采用泛素结合蛋白UBC作为内参基因，而研究叶状体在不同环境胁迫下的基因表达时，则可选择肌动蛋白ACT3作为内参。若使用一对基因作为候选基因，eIF4A和EF是最合适的。