海带(Saccharina japonica)内参基因筛选及部分管家基因的系统进化分析

摘要

荧光定量PCR（qPCR）是进行基因表达量测定最准确易行的方法，近年来，它被越来越多的应用于探讨功能基因表达量变化的研究中。运用荧光定量PCR研究基因表达时，需要内参基因对实验过程进行校正，因此选择合适的内参基因对于得出准确的实验结果具有重要的意义。本研究中共选用了8个候选内参基因：Actin（肌动蛋白），EF1α（翻译延伸因子1α亚基），UBA80（泛素融合蛋白80），GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶），UBA52（泛素融合蛋白52），18S（核糖体18S亚基），TUA（微管蛋白α亚基），TUB（微管蛋白β亚基）。这些管家基因都是古老的基因，在生物界中广泛分布。
　　在褐藻中除了水云基因组大规模测序注释分析中所获得的序列，还未见对这些管家基因克隆的报道。本研究对除18S外的另7个基因在海带中首次成功进行了cDNA水平上的克隆，所获得的7个基因序列长度分为：Actin，1131bp；EF1α，1323bp；α-Tubulin，1362bp；β-Tubulin，1341bp；GAPDH，1002bp；UBA80，468bp；UBA52，387bp，相应的GC含量分别为62.8％，61.5%，65.4%，62.4%，59.4%，62.9%，59.9%，它们在各种藻类（红藻、褐藻、绿藻、硅藻、隐藻、灰胞藻、定鞭藻）、高等植物、原生动物、原核生物和古菌中都有广泛的分布。因此运用上述序列对部分内参基因（Actin，EF1α，GAPDH，TUA，TUB）构建系统发育树，结果表明这些基因的起源都不尽相同，它的起源进化包含了复杂的生物学事件。
　　本研究在海带不同组织部位及不同生长时期的表达稳定性。通过荧光定量PCR得到各基因在各样品中的Ct值，然后通过对原始Ct值的统计分析，以及利用三种内参筛选软件（geNorm，NormFinder和Bestkeeper）对Ct值进行进一步分析发现，在海带不同组织部位中，geNorm的分析结果显示候选内参基因的稳定性由高到低为：EF1α，UBA80，TUA，GAPDH，TUB，UBA52，18S，Actin；NormFinder的分析结果显示候选内参基因的稳定性由高到低为：EF1α，UBA80，TUA，GAPDH，TUB，UBA52，18S，Act；Bestkeeper分析结果显示UBA80和EF1α的稳定性最好，而Actin在这三种软件的分析中稳定性均为最差。因此，在海带不同组织部位中，EF1α和UBA80为最稳定的内参基因组合。在海带的不同生活时期中，geNorm的分析结果显示候选内参基因的稳定性由高到低为UBA80，EF1α，Actin，TUA，TUB，UBA52，GAPDH，18S；NormFinder的分析结果显示候选内参基因的稳定性由高到低为UBA80，TUB，EF1α，UBA52，TUA，Actin，GAPDH，18S；Bestkeeper分析结果显示UBA80和TUB的稳定性较好，因此，在海带不同生活时期中，UBA80和TUB为最稳定的内参基因组合。而18S虽然自身表达量较为稳定，但是与其它候选内参基因的匹配度很差，因此不适宜作为双内参或多内参筛选中的成员。综合这两种实验条件，TUA，EF1α，UBA80，TUB这四个候选基因可以作为海带中内参基因的首选。

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1文献综述

1.1海带研究概述

1.2基因表达量测定的主要方法

1.3实时荧光定量PCR技术概述

1.4内参基因概述

1.5 七个管家基因（actin，EF1α，GAPDH，α-tubulin，β-tubulin，UBA52， UBA80）简介

1.6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料与主要试剂

2.2 实验方法

3 结果及分析

3.1内参基因克隆结果

3.2 部分内参基因的系统发育分析结果

3.3海带不同组织部位内参基因筛选的结果

3.4海带不同生长时期内参基因的筛选

3.5 海带不同组织部位和不同生长时期内参基因总评

3.6 关于在海带不同时期内参基因筛选中用18S校正其他内参基因表达量的研究

4 讨论

4.1 海带总RNA提取方法的改进

4.2 cDNA第一链反转录体系的优化

4.3 内参基因的克隆及系统进化分析

4.4 海带内参基因的筛选

4.5 基因多拷贝现象对内参基因表达量的影响

5 小结

参考文献

附 录

致谢

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