叉枝藻和海带提取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用的研究

摘要

黄嘌呤氧化酶（EC1.2.3.2，Xanthine Oxidase，缩写为XOD）是一种复合黄素酶，它广泛存在于细菌、真菌以及哺乳动物的组织中，是生物体内核酸代谢过程中一种极为重要的酶，它能催化体内的黄嘌呤和次黄嘌呤产生尿酸，并产生过氧化物自由基，尿酸浓度过高会导致高尿酸血症，引起痛风发作。近年来，黄嘌呤氧化酶抑制剂作为一种极为有效的抗痛风药物受到了国内外研究学者的广泛关注。因此，寻找生物来源的天然黄嘌呤氧化酶抑制剂可为以黄嘌呤氧化酶为靶点的抗痛风药物或保健品开发提供理论依据。
　　本文对海带和叉枝藻两种常见海藻乙醇提取物的黄嘌呤氧化酶抑制作用进行了深入的研究，通过单因素实验和正交试验优化了两种海藻的提取工艺；酶动力学方法分析了两种海藻提取物的抑制机理和抑制作用类型；等毒法测定了两种海藻水溶性组分与别嘌呤醇的联合抑制作用；本实验还检测了两种水溶性组分的自由基清除能力并简单分析了它们的化学成分。具体研究内容和结果如下：
　　建立了黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选体系，最终确定反应体系的测定波长为294nm，黄嘌呤底物浓度为0.6mmol/L，酶的终浓度为4μg/mL，反应 pH7.5，反应温度25℃，反应时间1min。
　　本实验采用超声波辅助的溶剂提取法对海带和叉枝藻中的黄嘌呤氧化酶抑制成分进行提取，结合单因素实验和正交试验的方法对浸提工艺进行了优化：最终确定海带的最佳浸提条件为：浸提温度30℃，乙醇浓度50％，超声时间15min，浸提温度4h。叉枝藻的最佳浸提条件为：浸提温度50℃，浸提时间4h，超声波破碎时间10min，乙醇浓度60%。
　　将两种海藻的乙醇提取物溶液用乙酸乙酯进行分液萃取得到乙酸乙酯组分和水溶性组分。实验表明，海带水溶性组分和乙酸乙酯组分的干物质得率分别为22.5%和1.23%，组间差异具有统计学意义（P＜0.01）。其IC50分别为0.71mg/m L和2.37mg/mL。选择抑制活性较强，得率较高的水溶性组分进行了动力学分析，该组分对黄嘌呤氧化酶表现为竞争性可逆抑制作用，抑制动力学常数Ki=0.086mg/mL。采用等毒法研究海带水溶性组分与别嘌呤醇的联合抑制作用，结果表明，水溶性组分与别嘌呤醇的联合抑制作用为协同作用。实验还测定了海带水溶性组分的自由基清除能力，结果表明，海带水溶性组分对羟自由基和超氧阴离子都有清除作用。
　　叉枝藻水溶性组分和乙酸乙酯组分的干物质得率分别为12.7%和0.30%，组间差异具有统计学意义（P＜0.01）。其IC50分别为0.43mg/mL和0.51mg/mL。选择抑制活性较强，得率较高的水溶性组分进行动力学分析，该组分对黄嘌呤氧化酶表现为竞争性可逆抑制作用，抑制动力学常数 Ki=0.37mg/mL。采用等毒法研究叉枝藻水溶性组分与别嘌呤醇的联合抑制作用，结果表明，该组分与别嘌呤醇的联合抑制作用为相加作用。实验测定了叉枝藻水溶性组分的自由基清除能力，结果表明，叉枝藻水溶性组分仅对羟自由基有清除作用。
　　综合两种海藻对黄嘌呤氧化酶的抑制作用研究，海带和叉枝藻的抑制活性成分多集中于水溶性组分中。

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第一章 前言

1痛风和高尿酸血症的概述

2 黄嘌呤氧化酶

3黄嘌呤氧化酶抑制剂

4 海洋藻类

5立项依据

第二章 海带提取物抑制黄嘌呤氧化酶活性的研究

1前言

2 实验材料、仪器与药品

4 实验方法

5实验结果

6 讨论

第三章 叉枝藻提取物抑制黄嘌呤氧化酶的研究

1前言

2 实验材料、仪器与药品

3实验原理

4实验方法

5实验结果

6 讨论

第四章 两种藻类水溶性提取物的化学成分检测

1 前言

2 实验材料与仪器设备

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

全文总结

参考文献

致谢