脊尾白虾全人工繁育及繁殖相关基因的研究

摘要

本研究首次解决了脊尾白虾全人工繁育技术，提出了人工控制亲虾同步性成熟的方法，以及受精卵人工孵化及幼体选优的方法，明确了幼体孵化、培育的适宜温度和盐度范围。同时借助分子生物学手段，克隆了脊尾白虾卵黄蛋白原(Vg)、卵黄蛋白原受体(VgR)和蜕皮激素受体(EcR)基因，并分析了Vg、VgR和EcR基因在脊尾白虾繁殖过程中的表达特征。主要结果如下：
　　一、脊尾白虾亲虾人工培育
　　1、脊尾白虾卵巢解剖结构与组织学特征
　　取卵巢发育不同阶段的脊尾白虾雌虾卵巢，研究了卵巢结构、组织学特征以及卵黄蛋白积累。结果显示，脊尾白虾卵巢一对，左右对称，中间分离，前后端愈合，成熟的卵巢外形呈“⊥”型或“橄榄球”型。随着卵巢发育，性腺指数逐渐增大，卵巢成熟时(IV期)最大，排卵后(V期)又降到最小；组织学特征显示，在卵细胞增殖期，细胞核清晰可见，一般能观察到1-2个沿核膜内侧分布的核仁，同时随着卵细胞逐渐成熟，卵原细胞周围的滤泡细胞逐渐增多，卵原细胞的卵黄蛋白逐渐增多。卵细胞成熟时，并未观察到类似对虾的皮质棒，明显的标志是细胞核消失，滤泡细胞数量减少。排卵后的恢复期，细胞核重新出现，卵原细胞又开始增殖，卵黄蛋白重新开始积累。
　　2、脊尾白虾亲虾人工培育及其同步性成熟调控方法的建立
　　提出了一种全人工培育脊尾白虾亲虾的方法，在24℃、26℃温度下，分别经过120天和110天的培育，80％雌虾性腺可达到成熟。此方法可切断其病原传播途径，在人工控制的养殖环境下实现脊尾白虾性腺同步发育成熟，为培育出健康优质脊尾白虾苗种打下良好的基础。
　　二、脊尾白虾受精卵人工孵化
　　1、不同温度和盐度对脊尾白虾胚胎发育速度的影响
　　选用实验室内人工控制交尾的脊尾白虾，研究了不同温度和盐度对脊尾白虾胚胎发育的影响。结果显示，5-30盐度范围内，盐度20时的孵化时间最短，但与5、10、15、25、30盐度组无显著差异(P>0.05)。脊尾白虾胚胎发育的生物学零度为12.18℃，有效积温为3828.27℃h。在15-28℃范围内，温度对脊尾白虾胚胎发育影响显著，胚胎发育时间随着温度升高而呈双曲线性缩短，而胚胎发育速度随着温度的升高而呈直线性加快，但当温度超过30℃时，胚胎无法正常完成发育。因此在脊尾白虾育苗中，幼体孵化温度不应低于12℃，最高不超过28℃，盐度控制在5-30范围内即可。
　　2、脊尾白虾受精卵人工孵化及幼体选优方法的建立
　　提出了一种脊尾白虾人工室内孵化及幼体选优的方法。主要包括以下特点：通过调节水温，可调控受精卵发育速度；可以将活力强幼体与活力差幼体、死亡幼体很好地分离，幼体变态为仔虾的存活率在85%以上；每尾抱卵虾单独培育，幼体孵化后亲缘关系明确，可用于家系建立及选择育种。
　　三、脊尾白虾幼体人工培育
　　1、不同温度对脊尾白虾幼体变态存活的影响
　　选用实验室内人工控制交尾的脊尾白虾，研究了不同温度对脊尾白幼体变态、存活的影响。结果显示，在盐度为31的条件下，脊尾白虾幼体变态发育速度随着温度的升高而加快，18℃、20℃、22℃、24℃、26℃和28℃各实验组开始出现仔虾的时间依次为17、14、11、9、8和8 d，各组90%以上幼体变态为仔虾的时间依次为21、18、15、14、11和11 d。各实验组在幼体变态过程中存活率都呈明显的阶梯式下降趋势，且28℃组的存活率下降最快，但当存活幼体全部变为仔虾时，各实验组间的存活率并无显著性差异(P>0.05)。18℃组仔虾干质量明显高于其它各组(P<0.05)，28℃组仔虾干质量最低，但与20℃、22℃、24℃和26℃组无显著性差异(P>0.05)。因此在脊尾白虾育苗中，幼体培育温度，建议控制在22-26℃为最佳。
　　2、不同盐度对不同日龄脊尾白虾生长发育的影响
　　选用室内人工培养的卵巢发育到II期的脊尾白虾雌虾以及性成熟雄虾，经逐级淡化，盐度稳定在5、10、15、20、25、30。雌抱卵孵化后，研究了不同盐度对溞状幼体变态、生长及存活的影响，以及不同盐度对仔虾后生长、存活的影响。结果显示，不同盐度对脊尾白虾溞状幼体的变态率和存活率无显著性影响，但对仔虾的干质量影响显著，15和20盐度下仔虾的干质量显著高于其它盐度组(P<0.05)；不同盐度对20日龄脊尾白虾的生长影响显著(P<0.05)，其特定生长率随着盐度升高而逐渐增大，在盐度20时达到最大(P<0.05)，当盐度超过20时其特定生长率又开始降低；同时由60日龄脊尾白虾鳃Na+-K+-ATPase的相对表达量可以看出，在高盐或低盐时Na+-K+-ATPase的相对表达量均较高，在盐度20时鳃Na+-K+-ATPase的相对表达量最低(P<0.05)，经二次方程拟合计算，理论 Na+-K+-ATPase的相对表达量最低时的盐度为17.53，此盐度可能为脊尾白虾成体的等渗点。因此，在脊尾白虾人工育苗及养殖过程中，建议适宜盐度控制在15-20。
　　3、不同日龄脊尾白虾对氨氮的耐受性
　　在水温24℃、盐度31、pH8.1的条件下，研究了氨氮对30日龄和120日龄脊尾白虾的毒性。结果表明，氨氮对30日龄脊尾白虾24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为155.81、116.71、92.55、80.40 mg/L，氨氮对120日龄脊尾白虾24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为178.80、156.37、140.28、120.86 mg/L。30日龄脊尾白虾总氨氮和非离子氨的安全质量浓度为8.04、0.26 mg/L，120日龄脊尾白虾总氨氮和非离子氨的安全质量浓度为12.09、0.50 mg/L。因此，在脊尾白虾养殖过程中，水体中的非离子氨浓度不应超过0.26 mg/L。
　　四、脊尾白虾卵黄蛋白原基因的克隆及其在卵巢发育过程中的表达分析
　　首次克隆得到了脊尾白虾卵黄蛋白原基因(Vg)cDNA，全长7841 bp，开放阅读框7632 bp，编码2543个氨基酸。脊尾白虾Vg氨基酸与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)一致性最高为75%，与高背长额虾(Pandalus hypsinotus)一致性为62%，与日本仿长额虾(Pandalopsis japonica)为61%，而与对虾科的对虾一致性却相对较低，为33-38%。该蛋白存在7个 N-糖基化位点(N151，N159，N168，N614，N660，N936和 N2306)，而在枝鳃亚目中几乎没有糖基化位点。
　　荧光定量分析显示，脊尾白虾Vg主要在肝胰腺内表达，其次为卵巢，肌肉和鳃有微量的表达。卵巢发育期间，卵巢中Vg mRNA的相对表达量却是一直处于上升趋势，在第V期时达到最大；而肝胰腺中Vg mRNA的相对表达量在IV期时却最高，在V期的表达量下降至与I、II期水平。但在卵巢整个发育阶段，肝胰腺中Vg mRNA的相对表达量始终显著高于卵巢(P>0.05)，因此推测，在脊尾白虾卵巢整个发育过程中，Vg主要在肝胰腺内合成，只是在恢复期时卵巢中的Vg合成明显起到了协助作用，为脊尾白虾卵巢再次成熟奠定了基础。
　　五、脊尾白虾卵黄蛋白原受体基因的克隆及其在卵巢发育过程中表达模式
　　成功获得了脊尾白虾卵黄蛋白原受体基因(VgR)cDNA全长，开放阅读框5661 bp，编码1886个氨基酸。亲缘关系分析，脊尾白虾VgR与虾类的亲缘关系最近，其次为昆虫，而与鱼类等脊椎动物关系较远。脊尾白虾VgR含4种结构域，LDL-receptor class A domain，Low-density lipoprotein-receptor YWTD domain，EGF domain和Transmembrane region，是一种跨膜转运蛋白。
　　通过荧光定量PCR对该基因在各组织及卵巢发育期肝胰腺和卵巢内的表达分析显示，脊尾白虾VgR在肝胰腺、卵巢、鳃和肌肉中均有表达，但主要在卵巢内表达，其次为肝胰腺。在卵巢发育过程中，卵巢内的VgR的表达量呈现先升高后降低又升高趋势，在III期的表达量显著高于I、II期(P<0.05)，IV期的表达量最低(P<0.05)，而在V期时表达量达到最大(P<0.05)；随着卵巢的发育，肝胰腺内VgR的表达量在IV时显著高于其它时期的表达量(P<0.05)，I和V期的表达量相近(P>0.05)，II和III的表达量最低。在卵巢整个发育过程中，卵巢内 VgR的表达量始终显著高于肝胰腺内的表达量(P<0.05)。结果表明，脊尾白虾VgR对Vg的转运可能存在一个平衡，即当卵巢成熟时由肝胰腺分泌到血液中的部分Vg被肝胰腺VgR又重新转移至肝胰腺内，而为下次卵巢发育准备，在排卵后的恢复期肝胰腺中VgR表达量的降低和卵巢中VgR表达量的升高也说明，VgR对Vg的转运在不同阶段是有方向性的。
　　六、脊尾白虾蜕皮激素受体基因的克隆及其在卵巢和胚胎发育中表达分析
　　首次克隆得到了脊尾白虾蜕皮激素受体(ECR)基因cDNA，全长2638 bp，开放阅读框1713bp，编码570个氨基酸。系统进化分析，与已知的甲壳动物ECR亲缘关系最近，而与昆虫亲缘关系较远。荧光定量分析显示，脊尾白虾ECR除在血细胞中不表达外，在其它各组织器官中均有分布，主要在受精卵和肝胰腺中表达，而在肌肉、卵巢、大额腺和鳃等组织中的表达却相对较低。
　　卵巢发育不同阶段，肝胰腺中ECR和HSP90的表达量变化与Vg的表达量呈正相关性，推测在肝胰腺中ECR与HSP90主要参与了Vg的合成；卵巢中ECR与性腺成熟相关，ECR的表达量在III期达到最高(P<0.05)，而III期是生殖蜕皮前蜕皮激素含量高峰期。
　　脊尾白虾胚胎发育过程中，ECR的表达量随着胚胎发育呈逐渐上升趋势，在Zoea I达到最大(P<0.05)；HSP90的表达量随着胚胎发育逐渐升高，在前溞状幼体期(Protozoea)达到最大，而后稍有下降，但仍维持在较高水平；Vg在受精卵和十六细胞期均无表达，囊胚期和无节幼体有微量表达，前溞状幼体表达量显著升高，后溞状幼体表达量达到最大，但与溞状幼体I期表达量无显著性差异(P>0.05)。

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第一章 文献综述

0 引言

1 脊尾白虾基础生物学

2 脊尾白虾繁殖生物学

3 脊尾白虾人工繁育

4 存在及需要解决的问题

第二章 脊尾白虾亲虾人工培育

第一节 脊尾白虾卵巢解剖结构与组织学特征

第二节 脊尾白虾亲虾人工培育及其同步性成熟调控方法的建立

第三章 脊尾白虾受精卵人工孵化

第一节 不同温度和盐度对脊尾白虾胚胎发育的影响

第二节 脊尾白虾受精卵人工孵化及幼体选优方法的建立

第四章 脊尾白虾幼体人工培育

第一节 温度对脊尾白虾幼体变态存活的影响

第二节 盐度对不同日龄脊尾白虾生长发育的影响

第三节 不同日龄脊尾白虾对氨氮的耐受性

第五章 脊尾白虾卵黄蛋白原基因的克隆及其在卵巢发育过程中的表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3讨论

第六章 脊尾白虾卵黄蛋白原受体基因的克隆及其在卵巢发育过程中的表达模式

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第七章 脊尾白虾蜕皮激素受体基因的克隆及其在卵巢和胚胎发育中的表达分析

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

附

脊尾白虾室内人工养殖标准化管理

脊尾白虾饲养管理条例

参考文献

致谢

完成及发表的学术论文

申请发明专利