三种增塑剂(DEHP、DBP和TBAC)对牙鲆鳃细胞FG和斑马鱼胚胎的毒性作用研究

摘要

增塑剂（又称塑化剂），是一类工业用高分子材料助剂，被广泛添加到塑料制品中以提高塑料的柔韧性。因其在环境中的高迁移性，现已成为地球上最广泛存在的污染物之一。2011年台湾所爆发的“增塑剂风波”，进一步激起了全社会对增塑剂毒性的广泛关注。由于水生生物大都是体外产卵、体外受精和体外发育，而增塑剂的生殖毒性和发育毒性可能会严重影响水生生物种群的未来。目前有关增塑剂对水生生物毒性的研究报道还很少，也缺乏系统有效的针对增塑剂类污染物毒性特点的生物评价技术和体系，这很不利于人们对增塑剂毒性的预防和管理工作。
　　本文首先利用海水鱼类牙鲆的鳃细胞系（FG）比较研究了3种增塑剂邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和乙酰柠檬酸三丁酯（TBAC）的急性细胞毒性效应，采用MTT法、中性红（NR）吸收法、乳酸脱氢酶（LDH）释放法、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双荧光染色法和DNA ladder法，分别检测了以上三种增塑剂对牙鲆鳃FG细胞的活性影响、生长抑制、细胞膜损伤和细胞凋亡诱导效应。
　　从细胞形态上观察，这三种增塑剂都会对FG产生细胞毒性，随着处理浓度的升高和时间的延长，细胞皱缩变圆的数目也逐渐增多，说明这三种增塑剂的细胞毒性具有一定的浓度效应和时间效应。这三者的最低效应浓度（LOEC）分别为：DEHP为150μg/mL，DBP为50μg/mL，TBAC为150μg/mL。
　　MTT法分析结果表明，以上3种增塑剂对FG细胞的活性均有抑制作用，但浓度较低时（0.005~50μg/mL），抑制作用不明显，并且这三者之间没有明显的毒性差异，其在24 h和48 h的细胞活性抑制率分别约为96％和94%。当浓度达到150μg/mL时，才表现出明显的抑制作用，其毒性等级为：DBP>TBAC>DEHP。DEHP、DBP和TBAC对FG细胞24 h的抑制率分别为：96±0.19%、80.8±3.7%和91.9±3.9%；48 h的抑制率分别为：94.8±1.5%、62.8±2.5%和73.8±0.58%。这表明，以上3种增塑剂对FG细胞活性的抑制作用具有明显的时间效应，随着时间的延长，对FG细胞的抑制作用增强。
　　中性红（NR）吸收法分析结果表明，以上3种增塑剂都可以抑制 FG细胞的生长，而且这种抑制作用具有明显的浓度依赖性和时间依赖性，且毒性等级为：DBP>TBAC>DEHP。在0.005μg/mL时，DEHP、DBP和TBAC对FG细胞24 h的抑制率分别为：96.7±0.79%，95.8±0.65%和95.9±1.1%；48 h的抑制率分别为95.9±1.1%，93.3±0.8%和94.1±1.4%。DEHP、DBP和TBAC对FG细胞的24 h的IC50（半数抑制浓度）值分别为：290.4（242.0-348.6）、144.8（99.23-211.2）和217（176.3-267.2）μg/mL（95%的置信区间）；48 h的IC50值分别为：213.8（166.6-274.3）、108.3（71.05-165.0）和135.8（97.54-189.1）μg/mL（95%的置信区间）。可见，中性红吸收法更适合检测这三种增塑剂对 FG细胞的毒性作用。
　　乳酸脱氢酶（LDH）释放法分析结果表明，随着三种增塑剂浓度的升高，处理组FG细胞中的培养基上清中乳酸脱氢酶含量也随之升高，具有一定的剂量效应关系，其毒性等级也为：DBP>TBAC>DEHP。0.005μg/mL的DEHP、DBP和TBAC处理FG细胞24 h后的LDH相对活性最低，分别为：21.1±5.8%、33.4±0.8%和30.2±0.8%；而150μg/mL的DEHP、DBP和TBAC处理FG细胞24 h后的相对活性最高，分别为：48.4±0.5%、72.6±1.6%和52.2±5.7%。以上结果表明，3种增塑剂可破坏FG细胞的细胞膜，使细胞膜的完整性遭到破坏，致使FG细胞质中的LDH被释放到培养基上清中。
　　AO/EB双荧光染色结果表明，这三种增塑剂对 FG细胞的凋亡诱导效应很低，最高浓度（150μg/mL）的DEHP、DBP和TBAC处理FG细胞24 h后的凋亡诱导率分别为：2.4%、28%和6%。因此，没有检测到DNA ladder。
　　其次，本文还利用斑马鱼胚胎，比较研究了以上3种增塑剂的胚胎毒性，对这3种增塑剂对胚胎各个发育阶段产生的畸形特征、24 h的致死率和72 h的孵化率的检测结果表明，（1）这三种增塑剂均能影响胚胎的发育，4 h时可观察到胚胎自溶的现象，8 h时可观察到外包变缓的现象，12 h时可观察到无体节形成的现象，24 h时可观察到无头部形成的现象，48 h时可观察到色素沉积减少或缺失的现象，72 h时可观察到孵化率降低，并且出现心包囊肿的现象，96 h时可观察到脊柱弯曲的现象。（2）24 h的致死率研究结果表明：随着增塑剂浓度的升高，胚胎致死率也逐渐升高。在最低浓度时（0.005μg/mL），DEHP、DBP和TBAC的胚胎致死率分别为：16.7±5.8%、76.7±7.6%和18.3±2.9%。DBP的毒性较高，在50和150μg/mL时，胚胎全部死亡。而DEHP和TBAC在150μg/mL的致死率分别为65±5%和75±5%。（3）72 h的孵化率也随着增塑剂浓度的升高，孵化率逐渐降低。DBP在最低浓度（0.005μg/mL）时，胚胎的孵化率已经比较低，为16.7±8.2%；在50和150μg/mL时，孵化率为0。而DEHP和TBAC在150μg/mL的孵化率分别为21.7±12.6%和10±13.2%。
　　最后，通过比较三种增塑剂之间的毒性差异，对不同增塑剂毒性作用的可能机制进行了分析和讨论。TBAC对牙鲆鳃细胞FG和斑马鱼胚胎都具有毒性，并且毒性高于DEHP，这一结果与已报道的有关TBAC无毒的实验结果不一致。
　　综上所述，中性红（NR）吸收法比MTT法更适合检测这三种增塑剂对FG细胞生长的抑制作用，其检测结果与乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测结果相一致；24 h的吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双荧光染色法检测结果说明这三种增塑剂对FG细胞的致死可能不是通过凋亡诱导途径；通过观察这三种增塑剂对胚胎发育的影响，说明其对斑马鱼胚胎都具有胚胎毒性，表现为各种各样的畸形特征、胚胎致死和孵化率降低。这三种增塑剂对牙鲆鳃细胞FG和斑马鱼胚胎都具有毒性，其毒性等级为DBP>TBAC>DEHP。

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第一章 综述

1.增塑剂简介

2.增塑剂的分类

3.增塑剂的应用

4.增塑剂在环境中的迁移和分布

5.增塑剂的生物毒性研究概况

6.DEHP研究概况

7.DBP研究概况

8.TBAC研究概况

9．牙鲆鳃细胞系和斑马鱼简介

10．论文立题依据、研究内容和意义

第二章 三种增塑剂对牙鲆体外培养鳃细胞（FG）的细胞毒性研究

1．前言

2.材料与方法

3.实验结果

4.讨论

5.小结

第三章 三种增塑剂对斑马鱼胚胎的胚胎毒性研究

1.前言

2.材料与方法

３.实验结果

4.讨论

5.小结

总结

参考文献

致谢