南海深海微生物的分离培养及4株海洋新菌的分类鉴定

摘要

海洋环境是地球上最大的生态系统，为海洋微生物提供了极其多样的栖息环境。海洋微生物数量巨大，种类繁多；在海洋中，原核细胞的总数估计在1029左右。微生物资源如此丰富，其多样性等基础研究具有极其重要的作用。微生物多样性的分子生物学研究手段迅猛发展，而培养方法的研究则相对滞后，不利于更进一步研究微生物的各种生理生化特征以及更深入地开发微生物资源。
　　本论文获得南海一深海站点水样，现场对水样进行分离培养，对获得的细菌菌株进行了16S rDNA测序鉴定，分析了其可培养细菌的多样性，并进行了高通量分离培养方法的海上试验。另外，对分离自南太平洋的3株新菌，以及分离自青岛文昌鱼繁殖区附近的1株海洋新菌进行了分类鉴定。
　　对于南海深海站点的水样，利用传统平板培养法，从2216E及海水R2A培养基中分离保藏403株细菌，得到392株细菌的16S rDNA序列。结果表明，该区域细菌分为4个类群：变形菌门（Proteobacteria），放线菌门（Actinobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），其中变形菌门包括α-变形菌纲和γ-变形菌纲。392株菌共得到44个属，52个种。发现无论是种类还是菌株数量，α-变形菌纲均为优势类群。分离得到α-变形菌纲20个属，25个种，共223株细菌，占总数的56.9％；得到γ-变形菌纲7个属11个种，共44株，占总数的11.2%；得到放线菌纲7个属，7个种，共114株，占总数的29.1%；得到拟杆菌门6个属，7个种，共9株；厚壁菌门2个属，2个种，共2株。优势属为气微菌属（Aeromicrobium），赤杆菌属（Erythrobacter），远洋橄榄球形菌属（Pelagibaca），Roseivivax，食烷菌属（Alcanivorax），鞘氨醇宝盒菌属（Sphingopyxis），类诺卡氏菌属（Nocardioides）。优势种为 Aeromicrobium erythreum，Erythrobacter flavus，Pelagibaca bermudensis，Alcanivorax borkumensis，Sphingopyxis baekryungensis，Roseivivax halotolerans，Nocardioides marinus，Roseivivax lentus。
　　利用该区域海水进行微生物包埋及高通量培养的海上试验，发现通过简化的微球包埋技术可以在船上制得符合后续筛选要求的微球，然而其高通量培养装置仍需要进一步改进方能符合海上的各方面实验要求。
　　对南太平洋环流区的3株海水菌属（Aquimarina）的海洋新菌进行了鉴定，分别为SW024T，SW150T和XH134T。SW024T菌体呈长杆状，单个细胞0.3μm宽，3.0-66.0μm长。为严格需氧细菌，生长需要海盐。该菌株不能形成Flexirubin型色素，细菌色素的最大吸收峰是453nm和479nm。主要脂肪酸为 iso-C15:0（34.8%），iso-C17:03-OH（15.9%），iso-C15:1 G（10.5%），C16:010-methyl and/or iso-C17:1ω9c（9.8%）和iso-C15:03-OH（7.5%）。主要呼吸醌为MK-6，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺（PE）、五种无法鉴定的脂类（L1-L5）以及三种无法鉴定的氨基脂类（AL1-AL3）。16S rDNA序列发育分析表明属于海水菌属，相似度与之最近的是Aquimarina muelleri KMM6020T（96.1%）。根据该菌在表型特征和遗传特征分析上所表现出的特殊性，认定该菌为海水菌属的一个新种，命名为狭长海水菌（Aquimarina longa sp. nov.）。SW150T呈杆状，单个细胞0.2μm宽，2.5-4.5μm长，并在胞外附着一层分泌物。为严格需氧细菌。生长需要海盐。不能形成 Flexirubin型色素，细菌色素的最大吸收峰是477nm。主要脂肪酸为：iso-C15:0（19.6%），iso-C17:03-OH（13.8%），iso-C15:1G（10.7%），C16:1ω6c and/or C16:1ω7c（8.3%）和C16:010-methyl and/or iso-C17:1ω9c（7.7%）。主要呼吸醌为MK-6，极性脂主要包括磷脂酰乙醇胺（PE）、三种无法鉴定的脂类（L1-L3）以及一种无法鉴定的氨基脂类（AL）。16S rDNA序列发育分析表明属于海水菌属，相似度与之最近的是Aquimarina macrocephali JAMB N27T（97.8%），根据该菌在表型特征和遗传特征分析上所表现出的特殊性，认定该菌为海水菌属的一个新种，命名为太平洋海水菌（Aquimarina pacifica sp. nov.）。XH134T菌体呈长杆状，单个细胞0.5μm宽，5.4-77.8μm长。为严格需氧细菌。生长需要海盐。能形成 Flexirubin型色素，细菌色素的最大吸收峰是473nm。主要脂肪酸为：iso-C15:0（33.5%），iso-C15:1G（12.6%），C16:1ω6c and/or C16:1ω7c（11.7%），iso-C17:03-OH（8.6%），iso-C15:03-OH（7.3%），C16:010-methyl and/or iso-C17:1ω9c（7.0%）。主要呼吸醌为MK-6，极性脂主要包括磷脂酰乙醇胺（PE）、三种无法鉴定的脂类（L1-L3）以及一种无法鉴定的氨基脂类（AL）。16S rDNA序列发育分析表明属于海水菌属，相似度与之最近的是 Aquimarina macrocephali JAMB N27T（96.9%），根据该菌在表型特征和遗传特征分析上所表现出的特殊性，认定该菌为海水菌属的一个新种，命名为巨大海水菌（Aquimarina megateriumsp. nov.）。
　　此外，本实验室自青岛沙子口文昌鱼繁殖区附近海域的浅海底层海水，通过高通量分离培养方法分离得到一株海洋细菌，实验室编号 H61T。菌体短杆状，单个细胞0.72μm宽，1.25μm长。该菌为严格需氧菌。主要脂肪酸为：C16:1ω6c and/or C16:1ω7c（40.9%），C16:0（20.3%），C18:1ω7c（18.8%）。16S rDNA序列分析显示，与之相似度最近的是 Thalassolituus oleivorans MIL-1T（96.4%）和Oceanobacter kriegii IFO15467T（96.3%）。根据该菌在表型特征和遗传特征分析上所表现出的特殊性，初步鉴定该菌为大洋杆菌属的一个新种，命名为青岛大洋杆菌（Oceanobacter qingdaonensis sp. nov.）。

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第一章 前言

1.海洋微生物的多样性

2. 海洋微生物多样性研究概况

3 海洋新菌的分类鉴定

4 本论文研究的目的和意义

第二章 南海深海微生物的分离培养

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三章 三株海洋新菌新种—狭长海水菌（Aquimarina longa sp. nov.），太平洋海水菌（Aquimarina pacifica sp. nov.），巨大海水菌（Aquimarina megaterium sp. nov.）的分类鉴定

1. 实验材料与仪器

2. 实验方法

3. 结果与分析

4. 结论

第四章 海洋新种-青岛大洋杆菌（Oceanobacter

1. 实验材料与仪器1.1 菌株

2. 实验方法

3. 结果与分析

4. 结论

小结

参考文献

致谢

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