鳕鱼骨胶原肽与活性钙的制备及其抗骨质疏松活性研究

摘要

鳕鱼是全世界年捕捞量最大的鱼类之一，在我国分布广泛，具有重要的经济价值。鳕鱼在加工生产过程中会产生大量的废弃物，其中鱼骨占鳕鱼整体重量的15％。鳕鱼骨中含有丰富的胶原蛋白及多种矿质元素，是一种良好的天然蛋白源与钙源。本论文以太平洋真鳕鱼骨为原料，制备鱼骨胶原蛋白并研究其各项基本理化性质。使用商品蛋白酶水解制备鱼骨胶原肽，并研究不同分子量胶原肽对成骨样MG-63细胞作用机制的影响。本实验研讨鳕鱼骨活性钙的最佳制备条件，并对其生物利用度进行了研究。本论文以去卵巢大鼠为模型，探讨鱼骨胶原肽与活性钙的抗骨质疏松活性。本研究开拓了鳕鱼骨资源的应用领域，为开发新型鱼骨保健食品、推进水产品高值化利用的发展提供了一定的科学依据。
　　1.本论文以水产加工下脚料鳕鱼骨为原料，因此首先对其基本组成进行了分析。鳕鱼骨中蛋白质含量较高（14.5%），鳕鱼骨中含有7种必须氨基酸，占总氨基酸含量的26.02%。鳕鱼骨中Ca与P的含量分别达到20.78%和10.09%，其比值接近2:1。扫描电镜观察发现鳕鱼骨表面具有坚固致密的扁平板状的羟基磷灰石结晶；通过Van Gieson染色发现鳕鱼骨中含有大量的胶原蛋白纤维。
　　2.以鳕鱼骨为原料，通过不同方法制备胶原蛋白，并对所提取胶原蛋白的理化性质进行分析。使用低温酸法制备得到酸溶性胶原蛋白（Acid-soluble collagen, ASC）。氨基酸组成检测发现ASC中 Gly的含量最高，而His、Tyr及Ile的数量很少。SDS-PAGE电泳检测证明ASC为I型胶原蛋白，至少含有两条α(α1和α2)链、一条β链和一条γ链。傅里叶变换红外光谱和X-射线衍射等分析证明ASC较好的保持了天然螺旋结构。扫描电镜观察发现ASC冻干样品具有多孔的网状结构，且存在缠绕复杂的细丝结构。使用热水抽提法制备得到热水抽提胶原蛋白（Hot-water extracted collagen, HEC）。采用正交实验确定了制备的最佳条件:盐酸质量分数4%，酸处理时间18h，提取温度70℃,提取时间8h，样品提取率可达98.02%。制备4种HEC样品：45℃4h，45℃8h，70℃4h和70℃8h，氨基酸组成检测显示4种样品氨基酸组成无显著性差异，凝胶强度随制备温度的升高和时间的延长而显著下降。傅里叶红外变换光谱和扫描电镜观察显示HEC失去天然三螺旋结构。
　　3.以鳕鱼骨胶原蛋白为原料，以MG-63细胞碱性磷酸酶增长率作为活性筛选指标，使用胰蛋白酶对胶原蛋白进行酶解以制备鳕鱼骨胶原肽。以正交实验设计确定酶解优化条件参数为：酶解温度50℃，酶解时间90min，加酶量1.5%。在此优化条件下，ALP增长率为43.64%。以水解液为原料超滤获取高、低分子量组分：BCH1:2000Da　　4.采用正交实验确定活性钙最佳提取条件为：提取温度100℃，提取时间120min，酸混合比例1:2，酸质量分数15%，在此条件下提取率达到96.15%，其中酸质量分数对结果的影响最为显著。对CCM活性钙样品进行生物利用度实验，结果表明样品对大鼠没有显著毒副作用；与空白对照组相比，CCM低剂量组大鼠骨钙含量明显增加（P<0.05），中剂量、高剂量与碳酸钙组大鼠的骨钙含量增加极为显著（P<0.01）；且CCM高剂量组大鼠骨钙含量与相同钙水平的碳酸钙组无明显差异（P>0.05）。钙代谢实验测定结果显示 CCM高剂量组钙吸收率显著高于相同钙水平的碳酸钙组（P<0.05）。因此判断 CCM样品可作为一种有效的钙营养强化剂。
　　5.本实验采用去卵巢大鼠模型，探讨鱼骨胶原肽、活性钙以及肽钙混合复剂对骨质疏松症的预防及作用机理。结果表明各组大鼠的脏器指数与普通生化指标检测未见异常、子宫病理学检测无明显差异，说明样品具有较好的安全性。三种样品均可不同程度的下调血清中ALP和TNF-α的含量，其中BCH高剂量组、CCM与肽钙复剂的低、高剂量组均能显著抑制血清 TNF-α含量（P<0.05），这说明受试样品有助于降低摘除卵巢所导致的高骨转换状态，使大鼠的骨重建水平向正平衡状态恢复。与OVX组相比，CCM高剂量组、肽钙复剂的低、高剂量组骨骺端BMD值都有明显增加（P<0.05）；CCM与肽钙复剂的低（P<0.05）、高剂量（P<0.01）对股骨钙含量亦有显著的提高作用，表明活性钙与肽钙复剂能够有效削弱卵巢摘除所引起的松质骨的骨转换加快以及相应导致的骨量减少。骨组织形态学观察结果进一步表明，CCM与肽钙复剂均能有效提高骨小梁数目，恢复骨小梁三维网状结构，进而提高骨骼强度，降低卵巢摘除导致的骨质疏松性骨折发生率。RT-PCR实验结果表明BCH与CCM功效因子能够有效抑制RANKL因子的合成，可通过作用于OPG/RANKL/RANK系统对骨代谢进行调节，从而阻止过度的骨吸收，抑制骨质疏松症的发展。

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第一章 文献综述

1 胶原蛋白的研究进展

2 生物活性肽的研究进展

3钙

4骨构造与骨代谢

5 骨质疏松症的研究进展

6 论文的立题依据和研究内容

第二章 鳕鱼骨成分分析及组织结构研究

引言

1材料和仪器

2方法

3结果与讨论

4 结论

第三章 鳕鱼骨胶原蛋白的制备与理化性质研究

引言

第一节 鳕鱼骨酸溶性胶原蛋白的制备与理化性质研究

第二节 鳕鱼骨热水抽提胶原蛋白的制备与理化性质研究

第四章 鳕鱼骨胶原肽的制备及对成骨样MG-63细胞作用机制的研究

引言

第一节 鳕鱼骨胶原肽的制备

第二节 鳕鱼骨胶原肽对成骨样MG-63细胞作用机制的研究

第五章 鳕鱼骨活性钙的制备及其生物利用度研究

引言

1 材料和仪器

2 方法

3结果与讨论

4 结论

第六章 鳕鱼骨胶原肽与活性钙对去卵巢大鼠骨质疏松的预防作用研究

引言

1材料和仪器

2方法

3结果与讨论

结论

本论文创新点

参考文献

致谢

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