大菱鲆干扰素调节因子8(IRF-8)以及褐牙鲆IRF-2和IRF-8的分子特征及其诱导表达分析

摘要

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是中国北部沿海地区广泛养殖的鱼类资源，但是非常容易受到大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）的感染。同样，褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）作为另一种迅速发展的人工养殖渔业，也遭受到各种流行病毒的损害，在过去几十年里最常见的就是淋巴囊肿病毒（LCDV）的侵害。作为一种多功能转录因子，干扰素调节因子（Interferon regulatory factors, IRFs），在干扰素（Interferon, IFN）系统的转录调控、抗病毒反应、生长控制和病原体的免疫反应等方面起到非常重要的作用。对于这两种鱼的IFN系统相关知识的更好的理解，将会在控制病毒性疾病方面发挥一定的作用。到目前为止，褐牙鲆的IRF-1、IRF-3、IRF-5、IRF-7和IRF-10已经被研究报道出来了，但是褐牙鲆的IRF-2还没有被研究。另外，目前在鱼类中IRF-8的研究还很有限。
　　本文以大菱鲆和褐牙鲆为研究对象，采用同源克隆及RACE技术，分别从大菱鲆的头肾组织以及褐牙鲆的脾脏组织中克隆得到大菱鲆IRF-8基因的全长cDNA和基因组DNA、褐牙鲆IRF-2的全长cDNA以及褐牙鲆IRF-8的全长cDNA和基因组DNA。褐牙鲆IRF-2 cDNA（GenBank登录号：JF312911）全长为1819 bp，拥有一个长为993 bp的开放阅读框，可以编码331个氨基酸。同其它的IRF-2一样，褐牙鲆IRF-2在N末端拥有一个DBD区、一个IRF结合区域2（IAD2）和C末端的转录抑制区域（TRD）。大菱鲆IRF-8 cDNA序列（GenBank登录号：JQ219663）全长为2317 bp，褐牙鲆IRF-8 cDNA序列（GenBank登录号：FJ828965）全长为1854bp，它们都包含一个长为1263bp的开放阅读框，编码420个氨基酸。并且拥有相同的3个保守区域：一个N末端的DBD区、一个C末端的IRF结合区域（IAD）和一个位于DBD区的核酸定位信号。大菱鲆IRF-8基因组序列（GenBank登录号：JQ219665）长为4363 bp，褐牙鲆IRF-8基因组序列（GenBank登录号：FJ556995）长大约为5.7 kb。两个IRF-8的基因组序列都由9个外显子和8个内含子组成。
　　我们采用半定量 RT-PCR的方法分别检测大菱鲆 IRF-8、褐牙鲆 IRF-2和IRF-8三个基因的mRNA在12个健康组织中的表达情况，包括脑、鳃、胃、肠、心脏、头肾、体肾、肝、脾、性腺、肌肉和皮肤。结果表明这三个基因在12个组织中都是组成型表达的。褐牙鲆IRF-2、大菱鲆IRF-8以及褐牙鲆IRF-8在富含淋巴的组织中表达显著，尤其是在头肾、体肾和脾脏组织中，大菱鲆IRF-8在皮肤、肌肉和肝脏中表达较少，褐牙鲆IRF-8在肌肉中表达较少。由此可以推断，褐牙鲆IRF-2、大菱鲆IRF-8以及褐牙鲆IRF-8在免疫系统中能够发挥作用。
　　表达分析结果表明，虽然大菱鲆IRF-8在受到poly I:C和TRBIV刺激时都表现出了上调表达，但是poly I:C刺激的结果较早且较强，而且脾脏组织都显示出了最高和最早的诱导值。褐牙鲆IRF-2在受到poly I:C和LCDV刺激时是上调表达的，且脾脏组织中的诱导峰值是最早的。褐牙鲆IRF-8在受到的poly I:C和LCDV刺激时是上调表达的，但是poly I:C的刺激情况要略早。poly I:C的刺激情况是：鳃、头肾和肌肉在9小时刺激点时达到最大峰值，脾脏在3小时刺激点时达到最大峰值，诱导倍数分别是3.0倍、2.0倍、3.0倍和4.0倍。LCDV的感染情况是：脾脏、头肾、鳃和肌肉都在12小时刺激点时达到最大峰值，诱导值分别是4.0倍、3.0倍、3.0倍和3.0倍。这些结果为IRF-2和IRF-8在IFN抗病毒反应中发挥作用提供了可能性。
　　实验结果为深入研究大菱鲆和褐牙鲆干扰素系统的信号转导途径和有效开展大菱鲆以及褐牙鲆病毒性疾病的免疫防控工作奠定了基础。

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第一章 文献综述

1.1鱼类干扰素的研究进展

1.3 本项研究的目的与意义

第二章 大菱鲆IRF-8以及褐牙鲆IRF-2和IRF-8的基因克隆和序列分析

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3 结果分析

2.4讨论

第三章 大菱鲆IRF-8以及褐牙鲆IRF-2和IRF-8 mRNAs的组织分布研究

3.2 实验方法

3.3结果分析

3.4 讨论

第四章 大菱鲆IRF-8以及褐牙鲆IRF-2和IRF-8基因的表达分析

4.1实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果分析

4.4 讨论

结论

参考文献

致 谢

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