文昌鱼(Branchiostoma japonicum)转化生长因子beta基因的表达和免疫功能研究

摘要

头索动物文昌鱼是现存的与无脊椎动物原始祖先最接近的头索动物,是研究脊椎动物起源与进化十分珍贵的模式生物。转化生长因子β(TGFβ)是一种多功能的细胞因子,调节许多细胞进程,包括细胞的增殖、分化、迁移、炎症反应以及凋亡等。TGFβ在脊椎动物和无脊椎动物的多种物种中被鉴定。哺乳动物中存在TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3三种亚型。高等动物体内几乎所有的细胞类型,包括上皮细胞、内皮细胞、造血细胞、神经细胞和结缔组织细胞,均能产生TGFβ及其受体。
　　头索动物文昌鱼中只存在一种tgfβ成员,可能是脊椎动物tgfβ1、tgfβ2和tgfβ3基因的祖先形式。但是,目前对于文昌鱼TGFβ在调节免疫和炎症反应方面的功能了解甚少。此外,对于无脊椎动物TGFβ构-效关系的研究非常缺乏。本研究对青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)TGFβ基因的免疫功能以及构-效关系进行了研究。
　　首先,为了研究文昌鱼TGFβ蛋白的免疫功能,我们构建文昌鱼TGFβ成熟肽(mTGFβ)体外重组表达载体,转移到大肠杆菌并进行诱导表达。mTGFβ在包涵体中大量表达。重组mTGFβ纯化后,进行透析法复性。通过化学交联的方法检测到复性后的mTGFβ形成同二聚体。通过使用Boyden chamber研究mTGFβ对未激活的RAW264.7细胞迁移作用的影响,发现mTGFβ显著促进小鼠巨噬细胞迁移,说明文昌鱼TGFβ具有与脊椎动物TGFβ类似的功能——能够促进小鼠巨噬细胞迁移。研究mTGFβ对已激活的RAW264.7细胞迁移作用的影响,发现其能显著抑制已激活的RAW264.7细胞的迁移,此作用与在真鲷(Pagrus major)中发现的 TGFβ对已激活的头肾细胞、外周血白细胞的抑制作用相似。文昌鱼TGFβ对RAW264.7细胞迁移的促进和抑制作用意味着其具有与哺乳动物和鱼类一样的双向作用。通过qRT-PCR和ELISA方法检测mTGFβ对LPS诱导的细胞因子TNF-α和IL-1β表达的作用,发现mTGFβ能够抑制LPS活化的RAW264.7细胞中TNF-α和IL-1βmRNA的表达以及IL-1β释放,表明文昌鱼TGFβ也起着免疫抑制性因子的作用。
　　其次,为了研究文昌鱼TGFβ构-效关系,我们使用重叠延伸PCR方法得到文昌鱼TGFβ突变体片段(缺失WSTD位点的文昌鱼TGFβ成熟肽)。体外表达文昌鱼TGFβ突变体蛋白(MD),并研究WSTD位点对文昌鱼TGFβ蛋白免疫功能的影响。结果表明WSTD位点在文昌鱼TGFβ诱导或抑制巨噬细胞迁移,如RAW264.7细胞的迁移方面发挥关键作用。
　　总之,这些结果表明文昌鱼TGFβ具有与脊椎动物TGFβ相似的双向作用,暗示了TGFβ蛋白双向作用的起源。同时,TGFβ起着免疫抑制性因子的作用。此外,本研究重点突出了WSTD位点对于诱导和抑制巨噬细胞迁移作用的重要作用。

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第一章 文献综述

1文昌鱼

1.1 文昌鱼概述

1.2 文昌鱼在研究脊椎动物起源与进化方面重要价值

2 转化生长因子β

2.1转化生长因子β总体概述

2.2 转化生长因子β蛋白的结构

2.3 转化生长因子β的的活化机制

2.4 转化生长因子β的生物学功能

2.5 转化生长因子β构-效关系

2.6 文昌鱼转化生长因子β

3 研究的目的、意义及技术路线

3.1 本研究的目的和意义

3.2 主要技术路线

第二章 文昌鱼(Branchiostoma japonicum)转化生长因子β免疫功能研究及活性位点分析

1 前言

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2文昌鱼TGFβ三维结构分析

2.3重组蛋白pET30a/mTGFβ的原核表达

2.4 重组文昌鱼mTGFβ形成同二聚体的检测

2.5 重组文昌鱼mTGFβ对RAW264.7细胞迁移的影响

2.6 重组文昌鱼mTGFβ对细胞活化的抑制作用

2.7 基因突变方法寻找文昌鱼TGFβ成熟肽蛋白功能活性位点

3 结果

3.1 文昌鱼TGFβ三维结构

3.2文昌鱼TGFβ蛋白体外表达和纯化

3.3 重组文昌鱼mTGFβ蛋白形成同二聚体的检测

3.4 重组文昌鱼mTGFβ蛋白影响RAW264.7细胞迁移

3.5 重组文昌鱼mTGFβ蛋白对RAW264.7细胞活化的抑制作用

3.6 文昌鱼MD蛋白的体外表达和纯化

3.7 重组文昌鱼MD蛋白形成同二聚体的检测

3.8 重组文昌鱼MD蛋白影响RAW264.7细胞的迁移

3.9 重组文昌鱼MD蛋白抑制RAW264.7细胞活化

4 讨论与总结

参考文献

致谢

作者简介

硕士研究生期间发表的学术论文