高血糖激素(CHH)在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生理代谢中作用机制的研究

摘要

高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone,CHH)是一类非常重要的神经肽激素,在甲壳类体内行使多种重要功能。本文首先克隆得到凡纳滨对虾高血糖激素基因的全长cDNA序列,重组表达其开放阅读框(ORF),然后将纯化的重组高血糖激素注射到凡纳滨对虾体内,以此来研究高血糖激素对对虾生理代谢调控的影响,主要包括方面的内容:
　　⑴凡纳滨对虾高血糖激素基因的全长克隆和原核表达;
　　⑵注射重组高血糖激素对凡纳滨对虾鳃丝离子转运、血细胞防御、糖类代谢作用的研究
　　⒈凡纳滨对虾高血糖激素基因基因克隆和表达分析
　　通过RACE技术获得凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)眼柄高血糖激素(LvCHH)全长 cDNA序列,全长846bp,GenBank登录号:HM748790.2。序列分析表明 LvCHH基因含有65bp的5’端非编码区、436bp的3’端非编码区和345bp的开放阅读框,而且3’端非编码区含有保守加尾信号(AATAA)和poly(A)尾巴,开放阅读框编码114个氨基酸,信号肽长度为24个氨基酸,具有高血糖激素家族特有的标志肽段。同源性分析显示,LvCHH与相近物种的同源性较高,其中与刀额新对虾(Metapenaeus ensis)的同源性为76％,与斑节对虾(Penaeus monodon)的同源性的为65%,与云斑厚纹蟹(Pachygrapsusu marmoratus)的同源性为53%,这些序列中都含有保守的6个半胱氨酸残基;由系统进化树分析可知,LvCHH与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、斑节对虾、刀额新对虾聚为一枝,通过与同物种的不同CHH序列进行比较,推测LvCHH为CHH-A型中的一种基因;LvCHH基因在凡纳滨对虾腹神经、眼柄、心脏、肝胰脏和肌肉中均有表达,其中心脏和眼柄中的表达量较高,肌肉中的表达量较低,而鳃丝中没有表达。通过构建 LvCHH基因原核表达载体 p32a-LvCHH,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达含6个His标签的重组LvCHH融合蛋白,由带有 His标签的 Ni2+亲合层析柱纯化得到重组高血糖激素蛋白,经SDS-PAGE分析显示在20KD处有显著诱导条带,与预测的分子量大小基本一致,Western blot分析表明可以与anti-His抗体特异性结合,从而证明高血糖激素重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。在注射纯化重组高血糖激素后48h内,测定鳃丝Na+/K+-ATPase活力和血糖含量,结果表明,各处理组Na+/K+-ATPase活力在0-6h内呈峰值变化,均在1h时达到最大值,20和30μg纯化蛋白/shrimp-1处理组在1h时显著高于对照组水平(P<0.05)。
　　2.注射高血糖激素对凡纳滨对虾鳃丝信号通路和离子转运的影响
　　本部分研究了在注射重组高血糖激素对凡纳滨对虾鳃丝信号通路和离子转运的影响。实验共分为3个处理组(对照组、10μg纯化重组CHH蛋白/shrimp处理组、20μg纯化重组CHH蛋白/shrimp处理组),各处理组均设置3个平行,取样时间:0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、48h。结果表明:注射高血糖激素后,各处理组鳃丝生物胺含量均有显著变化,但是变化最明显的是NE, DA只在6 h,5-HT在3、6 h时显著高于对照组水平,说明响应高血糖信号最主要的生物胺是 NE,且不同处理组之间生物胺含量没有显著变化;各处理组cAMP含量只在1h时显著高于对照组水平,而cGMP含量在1-48 h内均显著高于对照组水平,说明起主要作用的是 cGMP,且存在一定的剂量效应关系;而响应 cGMP的蛋白激酶主要是 PKA;而三种离子转运酶首先响应的是Na+/K+-ATPase和HCO3—ATPase,V-ATPase活力在12 h后才开始显著高于对照组水平。血淋巴渗透压也是在12 h后开始显著升高。通过以上的分析,可以得出在注射高血糖激素后,信号传导的途径为:NE cGMP PKA和PKC三种离子转运酶血淋巴渗透压。
　　3.注射高血糖激素对凡纳滨对虾糖类代谢影响
　　本部分研究了在注射重组高血糖激素对凡纳滨对虾糖类代谢的影响。实验设计同上,结果表明,在注射高血糖激素后,肝胰脏cAMP和 cGMP的含量表现基本一致,都是在3-48 h内显著高于对照组水平,说明肝胰脏cAMP和cGMP响应高血糖激素的刺激在同一水平;肌肉中的糖原合酶活性没有变化而糖原磷酸化酶的活性在3-48 h内显著高于对照组水平,而肝胰脏中的GS和GP活力都有显著升高的变化,而肝胰脏和肌肉中的FBPase和PEPCK的活力都有显著变化,从以上结果可以看出,肌肉是响应高血糖激素的主要组织,在糖原合酶活力不变的前提下,糖原磷酸酶的活力增加,这样,葡糖产生的速度会大于葡糖消耗的速度,造成血淋巴中葡糖含量的升高。而糖异生在两个组织中都有作用,但主要是在肝胰脏的发挥作用,通过糖原分解和糖异生的共同作用,最终导致血糖含量的上升。
　　4.注射高血糖激素对凡纳滨对虾免疫防御指标的影响
　　本部分研究了在注射重组高血糖激素对凡纳滨对虾免疫防御指标的影响。实验设计同上,结果表明,血淋巴中DA的含量在6 h的时候显著高于对照组水平,而其他时间的含量与对照组相比没有显著变化,血淋巴5-HT的含量在0.5-12 h内均显著高于对照组水平,NE含量在3-12 h内显著高于对照组水平,由结果可以看出在高血糖激素的刺激下,血淋巴中首先做出响应的是5-HT,其次是NE,最后是DA。生物胺的变化导致血细胞的数量发生改变,血细胞数量在0.5-12内都显著高于对照组水平,这与5-HT的含量变化一致。酚氧化酶原的活力在3-48 h内显著高于对照组水平,酚氧化酶活力在1-6h内显著高于对照组水平,由结果可以看出,血细胞数量的变化伴随着酚氧化酶及酚氧化酶原活力的改变,但是酚氧化酶原的变化滞后于酚氧化酶,这可能是因为信号刺激处于血淋巴中的酚氧化酶由低活性的状态转变为高活性的状态,而伴随着酚氧化酶活性的升高,激活了酚氧化酶原的活力,进一步提供更多的酚氧化酶来应对外界的刺激。凡纳滨对虾的抗菌活力在0.5-6 h内显著高于对照组水平,而溶菌活性没有显著变化,说明高血糖激素对对虾血细胞防御机制的影响只是部分性的。

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第一章 文献综述

1. 甲壳类高血糖激素家族生理功能研究进展

1.1 高血糖激素基因克隆研究进展

1.2 高血糖激素研究方法进展

1.3 高血糖激素生理功能研究进展

2．本项目研究的目的和意义

第二章 凡纳滨对虾高血糖激素基因克隆和表达分析

第一节 凡纳滨对虾高血糖激素基因克隆

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第二节 凡纳滨对虾高血糖激素基因原核表达及活性验证

1 实验材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 高血糖激素在凡纳滨对虾生理代谢中调控机制的研究

第一节 注射高血糖激素对凡纳滨对虾鳃丝信号通路和离子转运的影响

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第二节 高血糖激素对凡纳滨对虾糖类代谢的影响

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第三节 注射高血糖激素对凡纳滨对虾免疫防御指标的影响

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历

发表的学术论文与研究成果