海洋季也蒙毕赤酵母菌油脂合成调控的研究

摘要

微生物油脂是制备生物柴油的新原料,已经受到广泛关注。目前微生物油脂发酵的成本太高限制了它的工业化应用。其中原因,一是传统的微生物油脂生产主要以葡萄糖或淀粉质粮食作为原料;二是油脂微生物利用碳水化合物转化为油脂的转化效率还较低。所以,进一步研究微生物油脂合成调控机制并提高油脂的合成效率,以及开发新的非粮食原料具有重要的理论及应用意义。
　　我们实验室前期研究发现,菊糖这种非粮食材料比较适合替代传统原料进行油脂发酵。然而在目前的油脂微生物中很少具有分泌菊糖酶的菌株。本研究从海洋环境筛选到1株具有菊糖酶活力而且能够合成高水平油脂的Pcla22酵母菌株。综合细胞形态、菌落特征、生理生化和26S rDNA分子特征,将其鉴定为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)。
　　采用高油脂水平的Pcla22菌株直接转化菊糖合成油脂,省去了菊糖水解预处理过程,简化了发酵工艺,这对降低微生物油脂生产成本以及菊糖的高效利用具有重要意义。据此,测试了 Pcla22菌株对菊糖的利用能力,其菊糖酶活力为11.5 U/ml。优化了发酵菊糖的发酵条件。在补料发酵条件下,发酵96 h后,其菌体生物量达到20.4 g/l,胞内油脂水平达到60.6％(w/w),糖转化为油脂的得率达到0.19 g/g。分析了油脂中脂肪酸成分,油酸和棕榈酸的含量超过了79.8%,其中油酸占到全部脂肪酸的57.9%。利用此菌株油脂制备了生物柴油,其生物柴油转化率高达84.3%,而且燃烧性能良好。
　　季也蒙毕赤酵母菌株TJY22和Pcla22的油脂累积水平差别很大,相同条件下,TJY22菌株胞内油脂仅为19.4%(w/w),而Pcla22菌株则高达49.0%(w/w)。利用荧光定量 PCR方法检测了这两株油脂代谢相关的多个基因表达水平,发现TJY22菌株中丙酮酸羧化酶基因的表达水平非常低,仅为Pcla22菌株的7.6%。表明较低的丙酮酸羧化能力可能成为该菌株油脂合成的限速步骤。采用在培养基中添加CaCO3的方法提高了TJY22菌株的丙酮酸羧化反应,发现CaCO3不仅提高了胞内丙酮酸羧化酶活力,也提高了TJY22菌株胞内油脂水平。
　　将季也蒙毕赤酵母菌的丙酮酸羧化酶基因(PYC)和解脂耶罗维亚酵母菌ATP柠檬酸裂解酶基因(ACL1)在解脂耶罗维亚酵母ACA-DC50109菌株中进行了表达。研究发现,野生型菌株、P77(PYC转化子)和PA56(PYC和ACL1共转化子)的胞内油脂含量分别为30.2%(w/w)、38.2%(w/w)和45.3%(w/w);糖转化为油脂的得率分别为0.091 g/g、0.112 g/g和0.136 g/g;胞外柠檬酸浓度分别为0.5 g/l、11.5 g/l和6.2 g/l。表明丙酮酸羧化酶(PYC)和ATP柠檬酸裂解酶(ACL)在油脂和柠檬酸合成调控中有重要作用。丙酮酸羧化酶(PYC)促进了柠檬酸的累积,ATP柠檬酸裂解酶(ACL)又将柠檬酸定向引入脂肪酸的合成。所以,PYC和ACL1基因的共表达能够将增强丙酮酸羧化反应的碳代谢流导入到油脂合成,提高了碳水化合物转化为油脂的得率,这对解析微生物油脂合成调控机制以及解决油脂发酵中油脂低得率问题具有重要的理论和应用意义。

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第一章 研究背景

1 微生物油脂

2 产油微生物

3 微生物油脂合成与调控

4 微生物油脂的发酵工艺

5 微生物油脂应用领域

6 微生物油脂发酵问题和展望

7 论文立项依据和研究内容

第二章 高油脂水平季也蒙毕赤酵母Pcla22菌株的菌种鉴定

1 前言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 本章小结

第三章 季也蒙毕赤酵母菌Pcla22发酵菊糖产油脂的研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 本章小结

第四章 增强丙酮酸羧化反应提高了P. guilliermondii TJY22产油脂水平

1 前言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 本章小结

第五章 丙酮酸羧化酶在油脂合成调控中的作用

1 前言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 本章小结

全文总结与创新点

参考文献

附录

致谢

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