O-连接-N-乙酰葡萄糖胺转移酶的活性位点研究

摘要

氧连接的氮乙酰葡萄糖胺修饰(O-GlcNAc),是一种在真核细胞中普遍存在的蛋白质翻译后修饰,它是在1984年由Torres和Hart发现的。O-GlcNAc修饰是通过 OGT和 OGA这一对酶来实现的,OGT的作用是将 N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)通过β-构型 O-连接的糖苷键形式连接到目的蛋白的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基上;而OGA的作用则是去除GlcNAc修饰。目前,已经发现超过3000种蛋白质上存在 O-GlcNAc修饰,细胞中几乎所有的生物学功能都有它的参与。多种重大疾病的发生、发展过程中均检测到O-GlcNAc修饰水平的异常,包括肿瘤、糖尿病、以及神经性的退行性疾病等。
　　O-GlcNAc修饰与磷酸化修饰很相似,然而二者也存在很大差异,磷酸化是由几百种的激酶和磷酸酶来共同调控的,而生命体内只有两种基因来调控O-GlcNAc修饰:OGT和OGA。而且,关于OGT的酶活性位点确定仍然存在争议。在先前的研究证明OGT的H498和H558位点可能是OGT的活性催化位点, K898位点可能是一个与UDP-GlcNAc结合相关的位点,此外,D523和R637可能与 OGT与底物的结合相关。这些研究均使用人工合成的肽段作为底物进行OGT活性的检测。然而,上述位点是否在OGT催化不同的全长蛋白质底物的过程中也发挥着重要作用还是不清楚。本文构建了野生型和一系列突变型OGT的表达载体并进行重组表达,采用全长 CKⅡ和 Sp1重组蛋白作为底物进行 OGT活性检测,从而对OGT的活性和功能位点进行了探讨。
　　首先,本文采用定点突变的方法构建了一系列的OGT突变体:OGT-H498A, OGT-H558A,OGT-H498A/558A,OGT-D523A,OGT-R637A和OGT-K898A,并分别将它们和野生型OGT在pMAL-c2X表达系统中重组表达。接着,本文构建了底物蛋白CKⅡ的表达载体pET30a–CKⅡ,并将它和pET30a-Sp1在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功表达。之后,本文构建了 OGT及其一系列突变体与底物蛋白 CKⅡ和 Sp1的共表达菌株,并通过 IPTG诱导使OGT及其靶蛋白在共表达体系中成功表达。最后,我们通过检测共表达系统中底物蛋白的O-GlcNAc修饰水平反应OGT活性。结果显示OGT的H498A/H558A双突变体无活性,而其余的突变体均能检测出活性。由于共表达体系需要诱导表达较长的时间,并且很难控制酶与底物蛋白的量,容易导致过度反应从而影响酶活检测的准确性。因此,我们又进行了体外O-GlcNAc修饰实验。利用重组OGT蛋白在体外对重组底物蛋白进行O-GlcNAc修饰并利用免疫印迹检测修饰水平。体外糖基化修饰实验结果表明,野生型的 OGT和 D523突变的 OGT能检测能对底物蛋白进行有效的修饰,而且D523A突变可以提升 OGT的活性。
　　综上所述,本文利用分子克隆技术构建了一系列 OGT的突变体,构建了OGT底物蛋白 CKⅡ的表达载体,并将它们在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功表达;构建了野生型 OGT和其突变体与底物蛋白 Sp1、CKⅡ的共表达菌株;利用共表达体系和体外实验检测了 OGT的活性。实验表明,同时突变 OGT的H498和 H558位点可以导致 OGT活性的丧失,而突变 OGT的 D523位点对能促进OGT活性。本文为 OGT的活性位点和 OGT的催化机制研究提供了线索。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

1 O-GlcNAc转移酶(OGT)

2 O-GlcNAc转移酶的结构与功能

3 O-GlcNAc转移酶的催化机制

4 O-GlcNAc的测定方法

5 总结和展望

第一章 OGT突变体的构建及其重组表达

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果：

4 小结

第二章 OGT底物蛋白的构建及其重组表达

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结

第三章 OGT突变体的活性检测

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 展望

参考文献

致谢

个人简介

在读期间的学术成果