褐藻胶衍生物及褐藻糖胶对糖尿病及其并发症作用的研究

摘要

本文以丰富的海洋糖类化合物作为实验对象，利用糖尿病相关的细胞模型及体外筛选模型，并结合动物实验，研究了它们对糖尿病相关症状的治疗作用，并初步探讨了具有活性的糖类的作用机制。首次发现了低聚古罗糖醛酸硫酸酯(SLMG)对肝脏的脂类代谢具有显著的下行调控作用，并研究了其作用机理;首次发现了墨角藻（E.vesiaulosus）来源的褐藻糖胶(FNF)不但具有优于阿卡波糖的抑制α-糖苷酶活性，同时对糖尿病肾病也有治疗作用，并对其机制进行了探讨。
　　对人源肝细胞HepG2脂类代谢调控的结果显示，SLMG具有良好的降低甘油三酯及胆固醇合成的活性，其调控在0-100μg/mL剂量范围内呈现剂量依赖性，且对肝细胞无毒性。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)酶活力检测证明，SLMG可以抑制其活力，降低固醇合成速度。SLMG可以增加载脂蛋白A1(Apo AI)含量，提高HDL比例。一系列Western blotting实验结果显示，SLMG可以通过磷酸化AMPK，从而使其激活;激活的AMPK刺激下游ACC、HMGCR磷酸化，使它们失活，并抑制SREBP-1活性，从而减少甘油三酯、脂肪酸、胆固醇的合成;SLMG可以刺激SREBP-2的升高，通过SREBP-2启动LDLR基因表达，增加LDL的清除速度;同时可以促进CYP7A1的分泌，提高胆固醇转化为胆汁酸的效率，降低血管疾病发生率。
　　体外α-糖苷酶抑制实验结果显示，不同墨角藻目来源的褐藻糖胶普遍具有较好的抑制糖苷酶的活性，尤其是墨角藻（E.vesiaulosus）来源的褐藻糖胶(FNF)抑制活性最高，其半数抑浓度(IC50)为39μg/mL，活性远高于于阳性药阿卡波糖(387μg/mL)，双对数法测定其抑制方式为竞争性抑制。模拟胃酸降解证明胃酸不会降低其活性;酸降解分级实验表明其活性与分子量相关，只有较高分子量的组分具有活性。由于FNF是一种外观浅棕色且含有结合蛋白的粉末物质，其中可能含有微量多酚物质，经脱色以及采用酶法降解除蛋白后，几乎不影响其活性，并计算多酚类含量，表明FNF中的褐藻糖胶为唯一活性物质。对FNF进行细胞和动物实验:IEC-6细胞毒性试验表明FNF没有明显的细胞毒性;db/db小鼠试验说明FNF在短期（随机血糖、餐后血糖及空腹血糖）及长期（糖化血红蛋白）均有降低血糖，控制血糖升高的作用，这也印证了其具有抑制α-糖苷酶活性的结论。
　　抑制肾细胞HBZY-1增殖实验结果表明，褐藻糖胶普遍具有抑制肾细胞增殖，减缓肾脏纤维化的作用，且呈现剂量依赖性。FNF的抑制增殖能力最强，毒性试验显示:FNF对肠细胞IEC-6及肾细胞HBZY-1均无细胞毒性。Westernblotting研究表明:FNF通过降低TGF-β1、TGF-β1R的表达，减少骨架蛋白α-SMA的合成，并可抑制TIMP-1的表达，促使细胞外基质降解。FNF可有效阻止肾纤维化进程。
　　综上，首次发现低聚古罗糖醛酸硫酸酯SLMG可以有效调节肝脏的脂类代谢，并阐述了其作用机理。首次发现墨角藻（F.vesiaulosus)来源褐藻糖胶FNF不但具有优于阿卡波糖的抑制糖苷酶活性，有效降低模型鼠的餐后血糖及糖化血红蛋白，而且还有很好的抑制肾脏纤维化的作用，其作用机理也得到了阐述，FNF有作为多靶点糖尿病治疗药物潜力。本文的研究找到了两种针对糖尿病及其并发症有良好治疗作用的海洋糖类化合物，并阐述了其作用机理，为其临床研究提供了理论基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．褐藻

1．1．褐藻简介

1．2．褐藻胶

1．3．褐藻糖胶

2．糖尿病

2．1．糖尿病概述

2．2．糖尿病分类

2．3．糖尿病的历史

2．4．糖尿病并发症

2．5．糖尿病的治疗方法

3．立题依据及研究思路

参考文献

第二章 褐藻胶衍生物对脂类代谢的影响

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 试验方法

3 结果及讨论

3．1 不同种类海洋糖类影响HepG2细胞的脂质积累活性初步测定

3．2 SLMG的硫酸化相关检测

3．3 LMG及SLMG的HepG2细胞毒性检测

3．4 不同浓度LMG及SLMG对HepG2细胞的脂质积累的影响

3．5 LMG及SLMG抑制HMGCR酶活性

3．6 SLMG对载脂蛋白AI分泌的影响

3．7 SLMG对AMPK、HMGCR、ACC的磷酸化的影响

3．8 SLMG调节SREBP-1表达

3．9 SLMG调节SERBP-2及LDLR表达

3．10 SLMG调节CYP7A1表达

4 小结

参考文献

第三章 褐藻糖胶的α-糖苷酶抑制活性

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 不同种类海洋糖类α-糖苷酶抑制活性的初步测定

3．2 不同来源的褐藻糖胶的抑制活性

3．3 具有较好活性褐藻糖胶酶学参数测定

3．4 总酚含量测定

3．5 酸降解对活性的影响

3．6 蛋白对活性的影响

3．7 脱色对活性的影响

3．8 QFF分离组分活性测定

3．9 毒性研究

3．10 db／db小鼠试验

4 小结

参考文献

第四章 海洋糖类对糖尿病肾病的影响

1．引言

2．材料与方法

2．1．实验材料

2．2．试验方法

3．实验结果

3．1．抑制HBZY-1增殖活性初筛

3．2．细胞毒性测定

3．3．对HBZY-1细胞α-SMA分泌的影响

3．4．不同来源的褐藻糖胶活性测定

3．5．细胞周期测定

3．6．对基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1的合成的影响

3．7．对TGF-β1及其受体TGF-β1R合成的影响

4．小结

参考文献

结论

创新点

个人简介

学术成果

致谢