一株富含鲨烯的丛粒藻藻株鉴定、烃成分分析及缺氮对烃脂积累影响的初步研究

摘要

丛粒藻(Botryococcus braunii),又称布朗葡萄藻,隶属于绿藻门(Chlorophyta)、共球藻纲(Trebouxiophyceae)、丛粒藻目(Trebouxiales)、丛粒藻科(Botryococcaeae)、丛粒藻属(Botryococcus),是一种营串状集落生长的单细胞绿藻。生长过程中丛粒藻能够合成并储存大量烃类物质,其总烃含量一般超过细胞干重的30％,最高可达86%。就目前的研究来看,限制丛粒藻实际应用的主要因素是不能短时间内获得高的生物量以及烃含量。在丛粒藻的培养液中,氮元素是其生长的必需元素,但氮缺乏时能刺激烃脂的大量积累。本研究对一株分离自中国云南抚仙湖的丛粒藻Abt02藻株进行了细胞学观察,基于18S rDNA序列对该藻株进行了鉴定,重建了包含3个化学族的31株丛粒藻的系统发生关系,利用气相色谱质谱分析法测定了该藻株的烃成分,确定了其所属化学族分类及其烃成分,同时研究了缺氮培养条件下该藻株的生理特征变化以及与其烃合成有关基因的表达水平。
　　丛粒藻Abt02的细胞平均宽度为9.61±3.03μm,平均长度为14.27±1.09μm,细胞聚落颜色由培养初期的翠绿色逐渐变为稳定期的黄褐色。气质分析结果表明:丛粒藻Abt02藻株富含烃脂,并在稳定生长期大量积累;在指数生长期,烃含量占细胞干重30.60%;稳定生长初期,烃含量占细胞干重43.75%;烃脂成分中鲨烯以及羟基化衍生物含量高达87.54%;另外,该藻株含有具有重要生理活性的萜类物质—香叶基香叶醇。基于18S rDNA序列的分子分类表明,丛粒藻Abt02藻株与属于B化学族的藻株Ayame序列相似度最高,达99%。系统发生关系分析显示,包含3个化学族的31株丛粒藻可聚类为两大簇群:簇群I由化学族B和L组成,簇群II由化学族A组成,簇群之间的序列差异率为2.6%-3.5%,达到了种间差异率水平,建议将其界定为2个种。
　　缺氮培养条件下丛粒藻Abt02无明显的活跃生长期,且平均生长速率很慢。但缺氮培养条件下类胡萝卜素的含量随着培养时间的进行呈增长趋势,而正常培养条件下其含量增加不明显;缺氮培养45天时丛粒藻Abt02的类胡萝卜素与叶绿素的比例由正常培养条件下的0.16增长到0.74。随着缺氮培养时间的延长,丛粒藻细胞集落开始变得松散,慢慢的有单细胞游离出来,并在培养后期出现大量游离单细胞,且该藻细胞对缺氮具有很强的抗性,长时间(三个月左右)缺氮培养加入新鲜培养基,5天后藻细胞恢复生活力,开始进行分裂,而此时正常培养条件下的藻开始衰亡,细胞内容物渗出,细胞变得透明。
　　缺氮培养条件下烃含量要高于同时期正常培养条件下的烃含量,缺氮培养45天烃含量由正常培养条件下43.75%增加到56.89%。两种培养条件下烃成分无明显差异,但相比于正常培养,缺氮培养下鲨烯及其衍生物的含量呈增加趋势。经荧光定量分析,缺氮培养条件下鲨烯合酶基因的表达量要高于正常培养条件。同时缺氮培养条件下参与烃合成限速步骤的酶基因DXS、MCS、DLS的表达量也要高于正常培养条件。正是这些基因在缺氮条件下的高表达促使烃的大量积累。这为利用基因工程手段获得高含烃藻株奠定基础。

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第一章 文献综述

1 引言

1.1 丛粒藻作为能源微藻的优势

2 丛粒藻的研究现状

2.1 丛粒藻的形态学研究

2.2 丛粒藻的营养生理特性

2.3 丛粒藻的分类学研究

2.4 丛粒藻烃脂合成的分子生物学研究

2.5 丛粒藻中烃脂的提取

3 荧光定量PCR技术在丛粒藻中的应用

4 气相色谱质谱分析（GC-MS）在丛粒藻中的应用

5 本文的研究目的与意义

第二章 丛粒藻Abt02藻株的分子鉴定以及烃成分分析

1前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 藻细胞形态及大小

3.2 系统发育树的构建

3.3 气质结果与分析

4 讨论

第三章 缺氮对丛粒藻Abt02藻株烃脂积累影响的初步研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 两种培养条件下的生长曲线及生长速率和代时

3.2 两种培养条件下的色素含量

3.3 两种培养条件下的丛粒藻Abt02的细胞形态

3.4 两种培养条件下的烃含量及烃成分

3.5 两种培养条件下与烃合成有关基因的表达分析

4 讨论

4.1 丛粒藻生长曲线及色素含量

4.2 缺氮培养条件下的细胞形态

4.3 两种培养条件下的烃含量及成分分析

4.4 丛粒藻Abt02中关键酶基因的表达

参考文献

致谢

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