海洋真菌Cochliobolus lunatus中十四元大环内酯及其抗污损和杀菌作用

摘要

珊瑚礁低等无脊椎动物在激烈的生存竞争中演化形成了独特的化学防御机制,这些生物产生的化学防御物质是寻找发现海洋防污剂、杀菌剂及杀虫剂等的重要资源。本研究组从中国南海珊瑚、海葵、海绵等低等无脊椎动物中发现了一系列具有抗污损、杀菌、杀虫、抑藻等活性的化合物。然而受到资源限制,无法获得大量活性化合物。生态学研究发现,海洋无脊椎动物中的共附生微生物可能参与了宿主次级代谢产物的生物合成。受此启发,本研究从海洋共附生真菌中筛选发现抗污损、杀菌活性化合物,为海洋天然防污剂、农业杀菌剂的研究开发提供基础资料。
　　以2株海洋来源真菌 Cochliobolus lunatus(M351)和 C. lunatus(TA26-46)为研究对象,分离鉴定了14个十四元二羟基苯甲酸大环内酯(resorcylic acid lactones,简称 RALs)化合物,其中新化合物7个,新天然产物1个,通过结构修饰获得30个衍生物。对分离获得的化合物及其衍生物进行了抗污损、抗农业致病真菌等生物活性研究,获得抗污损活性化合物14个,初步探讨了构效关系;获得抗农业致病真菌活性化合物2个,并探讨了其杀菌作用机制。
　　1.真菌C. lunatus(M351)中十四元大环内酯分离、鉴定及其抗污损活性
　　本研究组前期从一种蕾二歧灯芯柳珊瑚 Dichotella gemmacea中获得一系列具有显著抗污损活性的 Briarane型二萜化合物,启示我们从柳珊瑚共附生真菌中筛选发现抗污损化合物。本研究从柳珊瑚 D. gemmacea中分离共附生真菌,在抗藤壶 Balanidae Amphitrite幼虫附着活性指导下,选择一株真菌 C. lunatus(M351)进行研究。对该菌进行发酵培养,综合运用各种分离手段和波谱学技术,分离鉴定了7个十四元大环内酯(1–7)。其中,1–3为新化合物,1和2的结构中含有自然界罕见的丙酮叉片段,3为罕见的卤代十四元大环内酯。抗藤壶幼虫附着活性结果表明,在无毒浓度下,化合物1、4、5、7具有显著的抗污损活性,EC50值分别为1.2、5.0、5.3、17.9μg/mL,远低于美国海军规定的潜在天然抗污损化合物 EC50值低于25μg/mL的标准。活性化合物1、4、5均具有较高的功效毒性比,LC50/EC50分别>16.7、>20.0、>18.9(当 LC50/EC50>15时,可视为无毒抗污损化合物),因此这些化合物具备发展成为新型无毒高效天然防污剂的潜力。
　　2.真菌 C. lunatus(TA26-46)中十四元大环内酯分离、鉴定、结构修饰及其抗污损、杀菌作用
　　基于十四元大环内酯独特的结构特点以及显著的抗污损活性,本研究试图对该类化合物进行深入研究。然而,真菌 C. lunatus(M351)代谢不稳定,再次发酵未获得目标化合物。通过文献调研、形态学比较、分子鉴定,并对发酵产物进行 HPLC-UV,NMR分析,从本实验室的海洋真菌库中获得了另一株能够产生十四元大环内酯的真菌 C. lunatus(TA26-46),该菌分离自中国南海海葵Palythoa haddoni。通过发酵条件优化,确定使用大米固体培养基进行大规模发酵。从发酵产物中分离鉴定了12个十四元大环内酯(1、4–14),包括4个新化合物(8–10、12)。8–11为非对映异构体,区别在于 C-4′,C-5′构型不同,运用 CD激子手性法以及 ECD法确定了这4个化合物的绝对构型。化合物12为罕见 C-8′位有羟基取代的十四元大环内酯,从生源合成的角度考虑,确定了 C-4′,C-5′构型,C-8′的绝对构型由于受到化合物量的限制尚未确定。通过结构修饰获得30个衍生物。
　　采用抗藤壶幼虫附着、抗农业致病真菌等活性模型对分离获得的化合物及其衍生物进行活性筛选。在抗藤壶幼虫附着活性中,化合物1a、1b、4j、6、6d、6f、8、10、11、13具有显著的抗污损活性,EC50值分别为15.4、12.5、9.0、1.82、3.85、10.5、17.3、6.67、18.1、22.5μg/mL(EC50<25μg/mL),且 LC50/EC50>15,具备开发为高效、低毒、环境友好型天然防污剂的潜力。构效关系分析表明,羟基、顺式烯酮片段、丙酮叉片段等为活性基团。在抗农业致病真菌活性测试中,6显示了强杀菌活性。在对感染致病疫霉菌 Phytophthora infestans的马铃薯进行预防性叶面喷洒试验中,当浓度为200、60和20 ppm时,杀菌率分别为98％、98%和92%,与阳性对照甲霜灵活性相当(98%、98%和98%);在对感染致病疫霉菌 P. infestans的番茄进行灌溉试验中,当浓度为6 ppm时,杀菌率为86%;更显著的是,在对感染霜霉病菌 Plasmopara viticola的葡萄进行预防性叶面喷洒试验中,6的活性强于阳性对照甲霜灵,当浓度为6 ppm时,杀菌率为91%,而甲霜灵对该菌的杀菌率为0。此外,化合物6的杀菌作用机制是一个尚未阐明的新的作用机理。
　　本研究的创新性体现在:从海洋低等无脊椎动物及其共附生微生物的化学防御机制出发,寻找高效、低毒、天然海洋防污剂和农业杀菌剂;从柳珊瑚和海葵共附生真菌中分离获得了7个新的十四元大环内酯,通过结构修饰获得30个衍生物,丰富了该类大环内酯的结构;综合运用 CD激子手性法及 ECD法确定了新化合物的绝对构型,对该类大环内酯化合物绝对构型的确定具有参考价值;通过抗污损和杀菌活性评价,发现了多个高活性抗污损和抗农业致病真菌活性化合物,为开发高效、低毒、天然防污剂和农业杀菌剂提供了化合物基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

参考文献

第一章 真菌 Cochliobolus lunatus (M351) 中十四元大环内酯化合物分离鉴定

第一节 柳珊瑚 Dichotella gemmacea 来源真菌的分离与筛选

第二节 真菌C. lunatus (M351) 中十四元大环内酯化合物分离鉴定

小结

参考文献

第二章 真菌 Cochliobolus lunatus (TA26-46) 中十四元大环内酯化合物分离鉴定

第一节 海葵来源真菌C. lunatus (TA26-46) 的筛选及代谢优势

第二节 真菌 C. lunatus (TA26-46) 中十四元大环内酯化合物分离鉴定

小结

参考文献

第三章 十四元大环内酯化合物结构修饰与生物活性评价

第一节 十四元大环内酯化合物的结构修饰

第二节 十四元大环内酯化合物及其衍生物的抗污损活性

第三节 十四元大环内酯化合物及其衍生物的抗农业致病真菌活性

第四节 十四元大环内酯化合物及其衍生物的其他生物活性

小结

参考文献

综述

结论与创新点

攻读博士期间发表的论文及专利

附图

致谢

个人简历