靶向调节NLRP1炎症小体介导的神经元焦亡治疗阿尔茨海默病

摘要

目的:研究NLRP1炎症小体对β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）诱导的皮层神经元焦亡的作用，及其在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)发生中的机制，探讨靶向调节脑内NLRP1炎症小体对APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠认知功能和脑内神经病理的影响。
　　方法:1、离体层面:分离纯化大鼠皮层神经元，应用不同浓度的Aβ1-42作用于神经元，测定神经元活力和乳酸脱氢酶(LDH)释放量，通过TUNEL染色阳性细胞计数，ASC荧光染色，了解神经元的焦亡情况;同时，采用免疫印迹法检测Aβ1-42作用下NLRP1表达、Caspase-1活性水平，ELISA检测IL-1β表达水平。应用小于扰RNA(siRNA)技术，了解NLRP1炎症小体信号通路在Aβ1-42诱导的神经元焦亡过程中的作用。2、活体层面:选取雄性3月、6月及9月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠以及其对照同源野生小鼠，通过免疫印迹法、荧光共定位法测定脑组织神经元中NLRP1随年龄变化的表达情况。之后选取5月龄APPswe/PS1dE9小鼠，随机分为干扰组和对照组。干扰组于第三脑室通过微型渗透泵持续输注NLRP1或Caspase-1 siRNA(0.11μ l/h)以抑制脑内NLRP1或Caspase-1的表达;对照组输注对照siRNA(0.11μl/h)。6周后，干扰效率通过免疫印迹法以及RT-PCR法确认。通过Morris水迷宫测定小鼠空间学习记忆能力。通过免疫印迹法测定脑中Caspase-1活性水平、IL-1β表达水平的变化;通过TUNEL染色观察小鼠皮层、海马区神经元TUNEL阳性细胞百分比变化，尼氏染色观察神经元细胞浆中的尼氏小体(Nissl body)变化，免疫组化观察胞外淀粉样斑的变化。
　　结果:1、离体层面:5μ mol/L Aβ1-42与原代培养的大鼠皮层神经元共同孵育24h诱导神经元焦亡，表现为TUNEL染色阳性细胞数增多，LDH释放量增加，ASC斑形成;同时NLRP1表达水平升高，Caspase-1激活，IL-1β释放增多。用NLRP1 siRNA对大鼠皮层神经元进行预处理48h后再加入Aβ1-42共同孵育，发现靶向抑制NLRP1对Aβ致神经元焦亡损伤有明显的保护作用，表现为TUNEL染色阳性细胞数减少，LDH释放量减低;同时活化态Caspase-1明显降低，IL-1β释放减少。2、活体层面:与同月龄对照小鼠相比，6月龄和9月龄APPswe/PS1dE9小鼠脑神经元中NLRPI水平显著升高。给予NLRP1或Caspase-1 siRNA6周能降低APPswe/PS1dE9小鼠脑内NLRP1或Caspase-1水平约50-60％。同时，干扰组小鼠脑内IL-1β水平明显降低;神经元胞浆中Nisslbody改变减轻、数量增多，神经元TUNEL阳性细胞百分比减低，而胞外淀粉样斑尚未见明显变化。此外，Morris水迷宫隐蔽平台实验中，干扰组小鼠寻找平台潜伏期及游行距离较对照组明显缩短;空间探索实验中，干扰组小鼠在目标象限游泳时间较对照组明显延长。
　　结论: NLRP1炎症小体信号通路在Aβ诱导的神经元焦亡过程中发挥重要作用。靶向抑制脑内NLRP1或Caspase-1表达可改善AD转基因小鼠空间学习记忆能力以及脑内神经元焦亡。NLRP1炎症小体有可能成为抗AD药物作用的潜在新靶点。

目录

声明

摘要

前言

1 材料与方法

第一部分 离体实验

1．1 仪器与材料

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

第二部分 在体实验

1．1 仪器与材料

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

2 结果

第一部分 离体实验

2．1 Aβ对皮层神经元NLRP1炎症小体通路的影响

2．2 靶向抑制NLRP1对Aβ致神经元焦亡损伤的保护作用

第二部分 在体实验

2．1 APPswe／PS1dE9双转基因小鼠特征及脑内NLRP1炎症小体的变化

2．2 靶向抑制NLRP1对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠脑内神经元焦亡等病理的影响

2．3 靶向抑制NLRP1对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠空间学习记忆能力的影响

2．4 靶向抑制Caspase-1对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠病理及行为学的影响

3 讨论

3．1 炎症小体

3．2 NLRP1炎症小体与阿尔茨海默病

3．3 NLRP3炎症小体与阿尔茨海默病

3．4 炎症小体在神经系统疾病中的作用

3．5 细胞死亡方式

4．结论

5 主要创新点

参考文献

附录

致谢

个人简历

在学期间发表的学术论文