海洋水产品中缩醛磷脂的分离纯化及活性探究

摘要

缩醛磷脂广泛存在于哺乳动物或鸟类组织、血液、肌肉中，特别是脑组织中含量最高。由于sn-1位存在特殊的烯醚键结构，缩醛磷脂具有诸多生理生化活性。随着分子生物学的不断发展，在对各种人类疾病的发病机制和磷脂组学的研究中，缩醛磷脂的各种生理活性还在不断发现和证实。除哺乳动物外，缩醛磷脂还存在于海参、贝类及海胆、海星等低等海洋生物中。本论文首先对常见的海洋贝类中缩醛磷脂的含量与组成进行分析后，选择缩醛磷脂含量较高且低值的贻贝为研究对象，探究其加工过程中缩醛磷脂的变化，确定工业化提取缩醛磷脂的适宜前处理条件;之后，继续探讨以酶法和柱层析方法分别提取纯化贻贝及冰岛刺参中缩醛磷脂的最佳工艺条件，使用所建立方法提取得到贻贝、冰岛刺参及牛脑中缩醛磷脂及醚磷脂共5种纯品;最后对五种磷脂体外抗氧化损伤作用作出探究。
　　海洋贝类中缩醛磷脂存在广泛，所研究的6种贝类中均含有其缩醛型磷脂酰乙醇胺(pPE)与醚型磷脂酰胆碱(aPC)，且含量普遍较高，其中aPC百分含量最高的是红螺，其次为贻贝，而缢蛏中含量最低。pPE占总PE的百分比普遍略低于aPC占PC的百分含量，其中含量最高的是毛蚶和贻贝，其次是缢蛏和红螺，而栉孔扇贝与菲律宾帘蛤的pPE含量较低。整体来看，贻贝是6种贝类中aPC与pPE含量均较高的一种，分别占总PC和PE的38.79％与24.29％。pPE中主要分子种有p18∶0/20∶5、p18∶0/22∶2和p20∶1/22∶6，而aPC含量较高的分子种是a16∶0/22∶6及a16∶0/22∶5。同时，贝类也是良好的PUFA来源，特别是DHA与EPA型磷脂含量丰富。主成分分析(PCA)可以较好地依据磷脂组成分析多种生物样品的差异，且直观地反映在二维图中，并能够通过对变量贡献的分析筛选得到主要差异分子种，是快速有效的差异分析手段。经分析后，选用本地常见贝类中富含缩醛磷脂与醚磷脂且低值、易养殖的贻贝是作为最合适的原料，提取纯化并进一步探究缩醛磷脂的生物活性。
　　贻贝中pPE不仅含量较pPC含量高，且表现出更好的稳定性，经过煮熟、微波、热风及冷风干燥方式加工后，缩醛磷脂含量只有少量减少。煮熟和热风干燥加工的损失相对明显，约损失15％～20％，微波干燥及冷风干燥对缩醛磷脂的破坏并不严重，同时PUFA含量基本保持稳定，故选用冷风干燥为原料处理方式。在使用磷脂酶A1水解法富集pPE时，通过单因素条件实验，最终确定采用16 ml/g（正己烷/缓冲液=1/1，v/v）的反应体系体积，加酶量为8倍质量，在50℃下反应4h为富集pPE最佳工艺条件。柱层析提取磷脂时首先选用2倍体积冷丙酮来沉淀磷脂，在进一步纯化缩醛磷脂时，分别使用5倍柱体积氯仿及3倍柱体积氯仿/甲醇(9/1，v/v)洗脱硅胶柱后最终使用3倍体积甲醇洗脱可收集得到纯度较高(97.11％)的磷脂，继续使用氯仿/甲醇/水(60/35/8，v/v/v)与氯仿/甲醇(2/3，v/v)梯度洗脱，最终PE与PC纯度均可以达到99.42％。最后，实验研究柱层析法直接分离PE中pPE的方法，发现正己烷/异丙醇/水的流动相体系在二醇基键合硅胶填料对普通PE与缩醛型PE具有一定的分离趋势，可以收集得到纯度约为90％的缩醛磷脂及醚磷脂。
　　实验最后考察了使用前几章所建立的方法提取纯化的5种缩醛磷脂及醚磷脂的受试物的体外抗氧化损伤效果。缩醛磷脂对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤具有显著的保护作用，缩醛磷脂及醚磷脂均可以抑制细胞内ROS的积累，提高细胞内T-AOC和SOD活性，从而降低了H2O2对细胞的氧化损伤，且海洋来源磷脂效果优于陆地来源，pPE效果优于aPC。缩醛磷脂在被吸收利用的过程中，其烯醚键结构并未被破坏，而是以整体形式吸收利用或在水解其sn-2位上脂肪酸后以溶血磷脂的形式被吸收利用。当选用玉米油作为载体，载样为10mg时，其总生物可吸收率为21.03％，其中45.88％为以pPE形式吸收利用，而有54.12％水解为其pLPE形式吸收利用。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1 贝类与海参概述

0．1．1 海洋贝类简介

0．1．2 海洋贝类的工业加工方式

0．1．3 冰岛刺参简介

0．2 醚型和缩醛型磷脂概述

0．2．1 醚磷脂和缩醛磷脂的分子结构

0．2．2 缩醛磷脂的来源

0．2．3 缩醛磷脂的生物活性

0．3 缩醛磷脂的提取与分离纯化

0．3．1 磷脂的提取

0．3．2 缩醛磷脂的碱法制备

0．3．3 缩醛磷脂的酶法制备

0．4 缩醛磷脂的定性及定量分析

0．4．1 薄层色谱层析分析法

0．4．2 碘消比色法

0．4．3 气相色谱与质谱联用法

0．4．4 液相色谱与质谱联用法

0．5 本研究的目的与意义

参考文献

1 海洋中6种贝类的磷脂含量及分子种组成分析

1．1 材料和仪器

1．1．1 实验原料

1．1．2 试剂和材料

1．1．3 主要仪器设备

1．2 实验方法

1．2．1 样品总脂提取

1．2．2 总脂含量测定

1．2．3 钼蓝比色法测定总磷脂含量

1．2．4 LC-MS／MS法测定磷脂分子种组成

1．2．5 主成分分析

1．3 结果与讨论

1．3．1 6种贝类中的磷脂含量

1．3．2 6种贝类的磷脂结构分析及分子种组成

1．3．3 PCA分析6种贝类中磷脂分子种的差异

1．4 本章小结

参考文献

2 海洋水产品中缩醛磷脂的加工变化分析及其分离纯化

2．1 加工过程中贻贝脂质变化及缩醛磷脂的含量变化

2．1．1 材料和仪器

2．1．2 实验方法

2．1．3 结果与讨论

2．2 磷脂酶A1水解法富集贻贝中的缩醛磷脂

2．2．1 材料和仪器

2．2．2 实验方法

2．2．3 结果与讨论

2．3 柱层析法分离纯化冰岛刺参中的缩醛磷脂

2．3．1 材料和仪器

2．3．2 实验方法

2．3．3 结果与讨论

2．4 本章小结

参考文献

3 海洋水产品中缩醛磷脂的体外抗氧化活性探究

3．1 海洋水产品中缩醛磷脂及醚磷脂对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用

3．1．1 材料和仪器

3．1．2 实验方法

3．1．3 结果与讨论

3．2 缩醛磷脂的体外消化生物可接受率

3．2．1 材料和仪器

3．2．2 实验方法

3．2．3 结果与讨论

3．3 本章小结

参考文献

4 总结

附录

论文创新点

致谢

个人简历

硕士在读期间发表的学术论文