单环刺螠纤溶酶的重组表达及活性研究

摘要

血栓类疾病是当今致死率、致残率最高的疾病之一，严重威胁人类的生活和健康。血栓类疾病的治疗已经成为当今医学界研究的重点问题之一。目前，溶栓药物已经发展至第三代，主要是以重组纤溶酶原激活剂为主，仍然存在很多缺陷，天然溶栓剂的研究为新型溶栓药物的发展提供了更广阔的空间。
　　实验室经过多年的努力，从一种海洋无脊椎动物单环刺螠中提取了一组具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，命名为单环刺螠纤溶酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ(UFEⅠ、UFEⅡ、UFEⅢ、UFEⅣ)。天然提取的UFE具有很好的抗凝活性和纤溶活性，其生物安全性也较高，但存在提取工艺复杂、纯化困难、产率低、成本高等弊端。为此，期望通过本文的研究，利用基因工程技术，外源表达获得有纤溶活性的UFE。本研究的主要内容是:
　　1.构建了pINA-1317-ufeⅡ和pINA-1317-ufeⅢ表达质粒并转入了解脂耶氏酵母中，经过大量菌株的筛选，未获得表达量高的菌株。构建了表达载体pPICZαA-ufeⅡ转入X-33，经过大量菌株的筛选，并没有发现表达量高的表达菌株。以上结果表明，UFEⅡ和UFEⅢ在酵母表达系统中表达不成功。
　　2.构建了pET32a-ufeⅡ表达系统，通过IPTG诱导，在OrigamiB(DE3)高表达菌株中表达了重组包涵体蛋白。对表达蛋白进行了包涵体复性，最后获得了有纤溶活性的重组UFEⅡ。针对pET32a-ufeⅡ表达系统表达的包涵体蛋白存在表达量不稳定的现象，做了相关毒性蛋白克隆表达策略的优化（如IPTG浓度、诱导时间和温度等），但效果不明显。
　　3.构建了pMSCG9-ufeⅡ表达系统，对融合表达蛋白进行了分离纯化，获得了有纤溶活性的重组UFEⅡ。
　　4.构建了pET32a-ufeⅢ表达系统，对表达的包涵体蛋白进行了复性和纯化，得到较纯的目的蛋白重组UFEⅢ，但并没有纤溶活性。
　　5.对纯化好的重组UFEⅡ用肽指纹图谱的方法进行了鉴定，证明所纯化的纤溶活性的蛋白是重组UFEⅡ。
　　6.用纤维平板法、纤溶蛋白降解实验和酰胺降解实验对重组UFEⅡ的纤溶活性进行了研究，证明了重组UFEⅡ不仅可以降解纤维蛋白还可以激活纤溶酶原，对纤维蛋白原的降解顺序依次为α链、β链、γ链;以多肽为底物，UFEⅡ酶促动力学反应常数是Vmax=3.74μM/min，Km=6.02 mM。
　　本研究通过分子克隆技术和蛋白质分离纯化技术对重组单环刺蜢纤溶酶在不同的表达系统中进行克隆表达。其中在pMSCG9-ufeⅡ表达系统和pET32a-ufeⅡ表达系统中都获得了有纤溶活性的UFEⅡ，并进行了活性研究。实验表明重组单环刺螠纤溶酶Ⅱ具有直接和间接降解纤维蛋白（原）的能力，为进一步对该酶的深入研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

前言

1 血栓类疾病的概述

1．1 血栓类疾病的危害

1．2 血栓的类型

1．3 血栓形成的机理

1．4 溶栓药物的现状

2 天然溶栓剂

3 体外异源表达系统

3．1 大肠杆菌表达系统

3．2 酵母表达系统

4 毒性蛋白的克隆表达

5 包涵体复性的相关研究

5．1 包涵体的形成

5．2 包涵体蛋白的复性机制

5．3 包涵体的处理方法

5．4 包涵体蛋白的复性方法

5．5 小结

6 立题依据与研究意义

第一章 单环刺螠纤溶酶的重组表达

第一节 真核表达系统的构建

1 pINA-1317-ufeⅡ和pINA-1317-ufeⅢ表达系统的构建

2 pPICZαA-ufeⅡ表达系统的构建

第二节 UFE的大肠杆菌表达系统构建

1 pET32a-ufeⅡ重组质粒的表达

2 pMCSG9-ufeⅡ重组质粒的表达

3 pET32a-ufeⅢ重组质粒的表达

4 蛋白表达条件优化实验

讨论

第二章 UFEⅡ体外活性研究

1．引言

2．材料和试剂

2．1 主要试剂

2．2 试剂配制

3 方法

3．1 纤维蛋白原平板实验

3．2 纤维蛋白原的降解反应

3．3 酰胺基降解实验

3．4 Bradford法测蛋白质浓度

4．结果

4．1 肽指纹图谱(PMF)进行重组蛋白鉴定

4．2 纤维蛋白(原)平板实验

4．3 纤维蛋白原的降解反应

4．4 酰胺基降解实验

讨论

总结

参考文献

致谢

个人简历