仿刺参(Apostichopus japonicas)肠道再生期巨大芽孢杆菌对生长、免疫、消化及肠道菌群的作用

摘要

本论文采用传统平板涂布计数法结合HiSeq2000高通量16S rDNA序列分析技术研究在仿刺参肠道再生过程中巨大芽孢杆菌H1对其肠道菌群的影响。同时通过分析仿刺参肠道相关免疫酶活（酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶）和消化酶活（蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶）、生长指标（体重和特定生长率）等，结合灿烂弧菌人工拮抗试验，进一步研究巨大芽孢杆菌H1对肠道再生期仿刺参生长、免疫和消化的作用。实验结果证明巨大芽孢杆菌H1能够显著减少仿刺参肠道的弧菌数量;降低因病原弧菌引起的仿刺参排脏率;对仿刺参幼参具有很好的保护作用，其排脏保护率可达92.31％;同时提高仿刺参的特定生长率3.00±0.34倍。以上研究为巨大芽孢杆菌H1在仿刺参保苗养殖中的广泛应用提供了科学依据。所获得的主要研究结果如下:
　　1.采用HiSeq2000高通量及传统平板涂布计数法发现:仿刺参幼参正常肠道细菌种类主要分布于变形菌门、浮霉菌门、放线菌门、厚壁菌门、疣微菌门、绿弯菌门、酸杆菌门等，其中变形菌门所占比例最大。肠道菌群是波动的，但是均以γ-变形菌纲为优势菌群，且其所占比例有不断增加的趋势。仿刺参正常肠道细菌的种类比再生期的更为丰富。
　　2.由于发生排脏，再生期仿刺参肠道除变形菌门和拟杆菌门，其他种类细菌所占比重较小，γ-变形菌纲在再生的不同阶段其所占的比例均在70％以上。巨大芽孢杆菌H1影响再生肠道菌群的结构，实验组A(加巨大芽孢杆菌H1)的芽孢杆菌数量一直显著高于空白对照组C和实验组B（不加巨大芽孢杆菌H1）（P＜0.05），在再生后期（第25天）实验组A、实验组B及空白对照组C可培养的弧菌数量分别占可培养的总异养菌数79.15％、91.52％、71.17％。说明H1在仿刺参再生肠道内能有效定植(可达107CFU/g)，并显著抑制弧菌的生长（P＜0.05）。
　　3.分析了仿刺参肠道相关免疫酶活（酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶）和消化酶活（蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶），发现肠道再生初期的酸性磷酸酶ACP和碱性磷酸酶AKP水平均显著低于正常肠道，伴随着肠道再生，ACP和AKP水平逐渐提高，趋于正常水平。巨大芽孢杆菌H1在再生初期对仿刺参肠道ACP和AKP具有一定抑制作用，但在再生后期具有显著促进ACP和AKP水平的作用（P＜0.05）。不同于ACP和AKP，再生期肠道SOD水平显著高于正常肠道，可能是再生初期仿刺参的一种自我保护。之后SOD水平随着肠道再生不断降低，接近于正常肠道的SOD活性。同样，巨大芽孢杆菌H1在再生初期对仿刺参肠道SOD具有一定抑制作用。巨大芽孢杆菌H1对再生期仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶具有显著促进作用(P＜0.05)，但是只在再生初期显著提高仿刺参肠道脂肪酶活性（P＜0.05）。
　　4.处于肠道再生初期的仿刺参幼参其体质量显著下降，呈负生长状态。但在第10天，随着发现粪便的产生，表明幼参已初具消化能力且体重开始缓慢的上升，并在第12天呈正生长。水体中添加105 CFU/ml的巨大芽孢杆菌H1可显著促进仿刺参肠道再生期仿刺参特定生长率并增重(P＜0.05)。说明巨大芽孢杆菌H1可显著促进肠道再生期仿刺参的生长。
　　5.在巨大芽孢杆菌H1(5×106CFU/ml)人工拮抗灿烂弧菌(107CFU/ml)实验中，证实了巨大芽孢杆菌H1具有很好的保护仿刺参幼参的作用，其保护率为92.31％。其中阳性对照组的排脏率为(43.33±5.77)％，拮抗组的排脏率仅为(3.33±2.89)％，两者差异极显著（P＜0.01）。由此可见，巨大芽孢杆菌H1在仿刺参养殖中将有良好的应用前景。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．仿刺参的分类地位及作用

2．仿刺参养殖现状

3．仿刺参特殊的生理特征

3．1 休眠

3．2 排脏

3．3 再生

4．仿刺参再生期的免疫特征

5．仿刺参肠道消化酶的特征

6．仿刺参肠道菌群的特征

7．芽孢杆菌在水产养殖中的应用

7．1 芽孢杆菌在水产养殖中的作用

7．2．巨大芽孢杆菌生物学特征及应用

8．高通量测序技术应用于微生物生态研究

8．1 高通量测序与传统礅生物培养方法的比较

8．2 高通量测序与变性梯度凝胶电泳的比较

8．3 16S rDNA通用引物的选择

9．本论文研究的目的及意义

第二章 仿刺参肠道再生期间菌群结构的研究

摘要

前言

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 仿刺参幼参和菌株

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验培养基配制

2．2 实验方法

2．2．1 仿刺参肠道菌群DNA的提取与检测

2．2．2 16S rDNA-V4片段的扩增及高通量测序

2．2．3 稀释平板涂布法分析仿刺参肠道再生期肠道主要菌群

2．3 实验结果

2．3．1 高通量测序分析仿刺参正常肠道与再生期肠道菌群结构

2．3．2 稀释平板涂布法分析仿刺参肠道再生期肠道主要菌群

2．4 讨论

第三章 仿刺参肠道再生期间肠道免疫及消化能力的研究

摘要

3．1 实验材料和仪器

3．1．1 仿刺参幼参和菌株

3．1．2 实验仪器

3．2．实验方法

3．2．1 蛋白定量测定的方法

3．2．2 碱性磷酸酶(AKP)的测定方法

3．2．3 酸性磷酸酶(ACP)的测定方法

3．2．4 总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定方法

3．2．5 蛋白酶的测定方法

3．2．6 脂肪酶活力的测定

3．2．7 淀粉酶活力的测定

3．3 实验结果

3．3．1 仿刺参肠道再生期肠道酸性磷酸酶ACP的比活力变化

3．3．2 仿刺参肠道再生期肠道碱性磷酸酶AKP的比活力变化

3．3．3 仿刺参肠道再生期中肠道超氧化物歧化酶SOD的比活力变化

3．3．4 仿刺参肠道再生期肠道蛋白酶的比活力变化

3．3．5 仿刺参肠道再生期肠道淀粉酶的比活力变化

3．3．6 仿刺参肠道再期肠道脂肪酶的比活力变化

3．4 讨论

第四章 仿刺参肠道再生期的生长及灿烂弧菌拮抗实验

摘要

4．1 实验材料和仪器

4．1．1 仿刺参幼参和菌株

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 仿刺参肠道再生期的生长和特定生长率的测定

4．2．2 灿烂弧菌大工拮抗试验

4．3 结果

4．3．1 仿刺参肠道再生对体重和特定生长率的影响

4．3．2 仿刺参肠道再生期(第10天)肠道解剖图

4．3．3 灿烂弧菌人工拮抗试验

4．4 讨论

论文总结

参考文献

致谢

个人简历

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