pH及糖基化处理对菲律宾蛤仔原肌球蛋白性质的影响

摘要

菲律宾蛤仔属于我国四大养殖贝类之一，不仅味道鲜美、营养丰富，还具有很高的经济价值。“吃蛤蜊，喝啤酒”也是青岛带给世界各地游客的独有体验。作为人类常见的食物过敏原之一，由菲律宾蛤仔引发的过敏性疾病发病率也日益增高。本论文以菲律宾蛤仔主要过敏原——原肌球蛋白为研究对象，系统分析了其理化性质，探究了pH变化及糖基化对原肌球蛋白过敏原性的影响，并采用生物信息学软件对其抗原表位进行初步分析，为认识菲律宾蛤仔过敏及消减其过敏原性提供基础数据。主要研究结果包括:
　　1、分离并纯化了菲律宾蛤仔的主要过敏原——原肌球蛋白，并利用免疫学技术进行了鉴定。进一步对其理化性质进行表征发现，菲律宾蛤仔原肌球蛋白的分子量在37 kDa左右，等电点为5.1;糖含量为6.34％;对热比较稳定，经过沸水煮15 min，其IgG结合能力没有明显的变化。此外，采用RACE技术对表达原肌球蛋白的基因序列进行表征，发现其全长为855 bp，编码284个氨基酸。
　　2、不同pH处理能够部分改变菲律宾蛤仔原肌球蛋白的过敏原性。在不同的pH环境条件下，采用间接酶联免疫吸附实验、点印记、蛋白酶酶解实验、圆二色谱、表面疏水性及紫外光谱等系统解析了原肌球蛋白分子结构与过敏原性的变化。结果表明，pH从7.0下降至1.0，原肌球蛋白的结构趋于松散，表面疏水性降低了97.7％，免疫活性降低;在pH＞9.0的碱性条件下，原肌球蛋白的过敏性有所增高。这说明采用低pH处理能够部分降低菲律宾蛤仔的过敏原性。
　　3、核糖引发的美拉德反应能够有效降低菲律宾蛤仔原肌球蛋白的过敏原性。在核糖的作用下，原肌球蛋白发生美拉德反应，采用酶联免疫、点印记、圆二色谱、赖氨酸含量等对核糖与原肌球蛋白的美拉德反应产物进行解析，结果表明，在核糖作用12h后，原肌球蛋白的二级结构发生的明显的变化，α-螺旋含量下降了71.7％，蛋白表面疏水性增加了192％，有效赖氨酸含量降低了45.5％，过敏原性变化分析显示，美拉德反应产物的IgE结合能力下降76.2％，IgG结合能力下降86.8％。由此表明，核糖能够有效降低菲律宾蛤仔原肌球蛋白的过敏原性。
　　4、利用生物信息软件对菲律宾蛤仔原肌球蛋白的抗原表位进行预测分析。结果表明，原肌球蛋白的氨基酸序列较为保守，不同种类软体动物的序列之间同源性达到75％以上，有的可以达到90％以上。采用DNAstar、AntheProt生物信息学软件并结合2个在线网站对原肌球蛋白的线性表位区域进行预测，得到10个抗原表位。这些表位在整个序列中的分布较为平均，有7个肽段的位置与已经报道的表位区域存在部分重合的现象，再根据之前的实验结果筛选可能性最高的四个表位进行Fmoc固相合成，采用竞争点印记方法，利用兔抗蛤蜊血清和过敏患者血清对其活性进行初步验证。4个多肽均为主要过敏原表位。
　　综上所述，本研究对菲律宾蛤仔主要过敏原——原肌球蛋白的理化性质进行解析，阐明了pH处理及糖基化处理对原肌球蛋白过敏原性的影响，并进一步利用生物信息学技术分析了原肌球蛋白的抗原表位。该研究结果对于认清菲律宾蛤仔过敏原的基本性质，开发低过敏性或无过敏性贝类食品，保障消费者食用安全等具有积极的意义。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1 食物过敏原研究进展

0．2 软体类过敏原概述

0．2．1 软体类过敏原种类

0．2．2 菲律宾蛤仔相关研究

0．3 过敏原抗原性消减方法

0．3．1 物理法

0．3．2 化学法

0．3．3 生物法

0．4 表位研究概述

0．5 研究目的和意义

0．6 本论文的技术路线

1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白性质分析

1．1 引言

1．2 实验材料

1．2．1 主要试剂及生物材料

1．2．2 实验仪器设备

1．2．3 溶液配制步骤

1．3 主要方法

1．3．1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白纯化制备

1．3．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

1．3．3 免疫印迹

1．3．4 点印记

1．3．5 双向电泳

1．3．6 蛋白糖含量测定

1．3．7 热稳定性

1．3．8 差示扫描量热法测定蛋白的热性能

1．3．9 蛋白克隆及测序

1．4 结果与讨论

1．4．1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白的纯化鉴定

1．4．2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白等电点测定

1．4．3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白糖含量测定

1．4．4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白热稳定性

1．4．5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白热性能

1．4．6 菲律宾蛤仔原肌球蛋白克隆及测序

1．5 本章小结

2 不同pH条件下菲律宾蛤仔原肌球蛋白免疫活性变化

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 主要试剂及生物材料

2．2．2 实验仪器设备

2．2．3 溶液配制步骤

2．3 主要方法

2．3．1 SDS-PAGE

2．3．2 酶联免疫吸附实验

2．3．3 点印记

2．3．4 胃蛋白酶消化实验

2．3．5 圆二色谱测定

2．3．6 蛋白表面疏水性测定

2．3．7 紫外全波长扫描

2．3．8 数据分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白在不同pH条件下蛋白组分变化

2．4．2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白在不同pH条件下IgG／IgE结合能力变化

2．4．3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白抗酶解能力变化

2．4．4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白圆二色谱扫描结果

2．4．5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白在不同pH条件下疏水性变化

2．4．6 菲律宾蛤仔原肌球蛋白在不同pH条件下紫外吸收光谱变化

2．5 本章小结

3 糖基化对菲律宾蛤仔原肌球蛋白免疫活性影响

3．1 引言

3．2 实验原料

3．2．1 主要试剂及生物材料

3．2．2 实验仪器设备

3．2．3 溶液配制步骤

3．3 主要方法

3．3．1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白的糖基化改性

3．3．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．3．3 圆二色谱

3．3．4 蛋白表明疏水性测定

3．3．5 反应产物中有效赖氨酸含量测定

3．3．6 点印记

3．3．7 酶联免疫吸附试验

3．4 结果与讨论

3．4．1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后蛋白组分变化

3．4．2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后二级结构变化

3．4．3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后疏水性变化

3．4．4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后赖氨酸含量变化

3．4．5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后IgG／IgE结合能力

3．5 本章小结

4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白线性表位初步筛选

4．1 引言

4．2 主要方法

4．2．1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与其他5种原肌球蛋白过敏原同源性分析

4．2．2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白抗原性指数分析

4．2．3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白表位的在线工具预测

4．2．4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白表位的综合分析预测

4．2．5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与人和猪原肌球蛋白序列对比

4．2．6 预测表位的合成及纯度分析

4．2．7 合成表位活性分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与其他5种原肌球蛋白过敏原同源性分析

4．3．2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白抗原性指数分析

4．3．3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白表位的在线工具预测

4．3．4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白表位的综合分析预测

4．3．5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与人和猪原肌球蛋白序列对比

4．3．6 预测表位的合成及纯度分析

4．3．7 合成表位活性分析

4．4 本章小结

5 论文总结

6 论文的创新与展望

参考文献

致谢

个人简历

发表的学术论文