云纹石斑鱼细胞系的建立及初步应用研究

摘要

鱼类细胞培养起始于1960年。Wolf和Quimby1960年1月启动虹鳟性腺原代培养，经历21个月连续传了48代，在1962年发表了第一个鱼类细胞系，即虹鳟性腺细胞系RTG-2。之后，鱼类细胞培养进展迅速。建立鱼类细胞系所用的材料来自于鱼的各种组织，包括胚胎、脑、眼睛、鳃、骨、肌肉、表皮、鳍条、肿瘤及内脏组织等。鱼类细胞系已应用于鱼类病毒学、毒理学、生理学、转基因、肿瘤发生、细胞骨架及DNA损伤修复等方面的研究。
　　云纹石斑鱼(Epinephelus moara)生长速度快，肉质鲜美，价格昂贵，是中国沿海重要的养殖发展对象。然而，近年来虹彩病毒和其它病毒性疾病的爆发使得石斑鱼的工厂化养殖遭受很大的经济损失。石斑鱼可发生性别转变，雌性先性成熟然后再转换成雄性，是一种非常好的性反转模式研究动物。
　　以云纹石斑鱼的心脏、脑与肾脏组织为材料，建立了云纹石斑鱼心脏细胞系(Epinephelus moara heart cell line，EMH)、脑细胞系(Epinephelus moarabrain cell line，EMB)以及肾脏细胞系(Epinephelus moara kidney cell line，EMK)。以云纹石斑鱼的脾脏与性腺组织为材料研究了其组织细胞的分离与培养。细胞系所用的培养基是在L15基本培养基中添加了HEPES，抗生素，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，β-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，2-ME)和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的完全培养液。EMH细胞已传20多代，由成纤维细胞和上皮样细胞组成。EMB细胞已传60多代，主要由成纤维样细胞组成。EMK细胞已传50多代，由成纤维样细胞组成。本研究检测了温度及FBS浓度对EMH、EMB和EMK细胞生长的影响。
　　EMH细胞在18℃～30℃之间均能正常生长，其最适生长温度为30℃，在36℃时不能正常生长。FBS浓度在10％～20％之间细胞均能快速生长，最适FBS浓度为15％。染色体分析表明具有正常二倍体染色体数目(2n=48)的细胞所占的比例为62％。
　　EMB细胞在18℃～24℃之间，细胞的生长速度随着温度的升高而增加。但18℃生长最慢，在24℃与30℃时细胞能快速生长，其最适生长温度在24℃与30℃之间。在一定范围内，细胞的生长速度随FBS浓度的升高而明显增加，EMB细胞生长的最适FBS浓度为15％，染色体分析表明具有正常二倍体染色体数目(2n=48)的细胞所占的比例为56％。
　　EMK细胞的生长速度在18℃～24℃范围内随温度的升高而增加。18℃时细胞的生长速度较为缓慢，温度为24℃时细胞的生长速度最快，其最佳生长温度为24℃。在一定范围内，细胞的生长速度随FBS浓度的升高而明显增加，EMK细胞生长的最适FBS浓度为15％.染色体分析表明具有正常二倍体染色体数目(2n=48)的细胞所占的比例为58％。
　　用脂质体法将含增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的质粒载体pEGFP-N3转入EMH、EMB与EMK细胞后，增强绿色荧光蛋白基因成功表达。EMH、EMB与EMK细胞系的建立将为病毒的分离、鉴定和功能基因的研究奠定基础。

目录

声明

摘要

1 前沿综述

1．1 鱼类细胞培养发展历史概述

1．2 鱼类细胞培养技术概述

1．3 鱼类细胞系的应用

1．3．1 病毒学研究

1．3．2 毒理学研究

1．3．3 肿瘤学研究

1．3．4 生理学研究

1．3．5 鱼类种质资源保存与遗传学育种

1．4 本论文的研究意义

2 云纹石斑鱼心脏细胞系的建立、鉴定与应用

2．1 引言

2．2 实验材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂和仪器

2．2．3 原代培养

2．2．4 传代培养

2．2．5 细胞的冻存与复苏

2．2．6 不同温度对细胞生长的影响

2．2．7 FBS浓度对细胞生长的影响

2．2．8 染色体分析

2．2．9 pEGFP-N3转染

2．3 实验结果

2．3．1 原代培养与传代培养

2．3．2 细胞的冻存与复苏

2．3．3 温度对细胞生长的影响

2．3．4 FBS浓度对细胞生长的影响

2．3．5 染色体分析

2．3．6 外源基因转染

2．4 讨论

2．5 结论

3 云纹石斑鱼脑细胞系的建立、鉴定与应用

3．1 引言

3．2 实验的材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂与仪器

3．2．3 原代培养

3．2．4 传代培养

3．2．5 细胞的冻存与复苏

3．2．6 不同温度对细胞生长的影响

3．2．7 FBS浓度对细胞生长的影响

3．2．8 染色体分析

3．2．9 pEGFP-N3转染

3．3 实验结果

3．3．1 原代培养与传代培养

3．3．2 细胞的冻存与复苏

3．3．3 温度对细胞生长的影响

3．3．4 FBS浓度对细胞生长的影响

3．3．5 染色体分析

3．3．6 外源基因转染

3．4 讨论

3．5 结论

4 云纹石斑鱼肾脏细胞系的建立、鉴定与应用

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂和仪器

4．2．3 原代培养

4．2．4 传代培养

4．2．5 细胞的冻存与复苏

4．2．6 不同温度对细胞生长的影响

4．2．7 FBS浓度对细胞生长的影响

4．2．8 染色体分析

4．2．9 pEGFP-N3转染

4．3 实验结果

4．3．1 原代培养与传代培养

4．3．2 细胞的冻存与复苏

4．3．3 温度对细胞生长的影响

4．3．4 FBS浓度对细胞生长的影响

4．3．5 染色体分析

4．3．6 外源基因转染

4．4 讨论

4．5 结论

5 云纹石斑鱼性腺与脾脏细胞的离体培养

5．1 引言

5．2 实验材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验试剂和仪器

5．2．3 原代培养与传代培养

5．3 实验结果

5．4 讨论

5．5 结论

参考文献

致谢

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