声明
摘要
1 前言
1.1 微生物表面展示技术概述
1.1.1 微生物表面展示系统的组成
1.1.2 常用的锚定蛋白种类及其特性
1.2 微生物表面展示系统的种类
1.2.1 噬菌体展示系统
1.2.2 细菌展示系统
1.2.3 酵母展示系统
1.3 大肠杆菌表面展示系统
1.4 谷氨酸及其检测方法
1.4.1 谷氨酸简介
1.4.2 谷氨酸检测方法
1.5 谷氨酸脱氢酶
1.6 研究的目的及意义
2 来自于B.subtilis的谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌表面展示系统的构建
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌种与质粒
2.2.2 试剂和仪器
2.2.3 常用培养基及溶液配制
2.2.4 实验引物
2.3 实验方法
2.3.1 扩增目的基因
2.3.2 gldh基因的T-A克隆
2.3.3 表达载体pET-Inp-gldh的构建
2.3.4 表达载体pET-Inp-gldh转化入E-coli BL21(DE3)
2.3.5 重组蛋白INP-Gldh的诱导表达
2.3.6 SDS-PAGE分析融合蛋白1NP-Gldh的表达定位
2.3.7 表面展示菌株的Gldh活性分析
2.3.8 His-tag对INP-Gldh在大肠杆菌中可溶性表达的影响
2.3.9 不同表达载体对INP-Gldh在大肠杆菌中可溶性表达的影响
2.3.10 不同表达菌株对INP-Gldh在大肠杆菌中可溶性表达的影响
2.4 结果与分析
2.4.1 质粒pET-Inp-gldh的构建
2.4.2 重组蛋白INP-Gldh的诱导表达、SDS-PAGE分析及酶活测定
2.4.3 His-tag对INP-Gldll在大肠杆菌中可溶性表达的影响
2.4.4 不同表达载体对INP-GIdh在大肠杆菌中可溶性表达的影响
2.4.5 不同表达菌株对INP-Gldll在大肠杆菌中可溶性表达的影响
2.5 本章小结
3 来自于T-waiotapuensis的谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌表面展示系统的构建示系统的构建
3.1 实验材料
3.1.1 菌种与质粒
3.1.2 试剂和仪器
3.1.3 常用培养基和溶液
3.1.4 实验引物
3.2 实验方法
3.2.1 扩增目的基因
3.2.2 目的基因的T-A克隆
3.2.3 表达载体pTInaPb-N-Gldh的构建
3.2.4 表达载体pTInaPb-N-Gldh的转化及重组蛋白INP-Gldh的诱导表达
3.2.5 SDS-PAGE分析融合蛋白INP-Gldh的表达定位
3.2.6 表面展示菌株的Gldh活性分析
3.2.7 温度与pH对Gldh表面展示菌株酶活的影响
3.2.8 温度和pH对酶活稳定性的影响
3.2.9 底物特异性检测及米氏常数测定
3.2.10 各种离子对酶活的影响
3.2.11 细胞表面展示的Gldh检测L-谷氨酸
3.3 结果与分析
3.3.1 表达载体pTInaPb-N-Gldh的构建
3.3.2 融合蛋白INP-Gldh的诱导表达和SDS-PAGE分析
3.3.3 表面展示菌株的Gldh活性分析
3.3.4 Gldh表面展示菌株的最适温度和pH
3.3.5 温度和pH对表面展示菌株酶活稳定性的影响
3.3.6 底物特异性和辅酶特异性检测
3.3.7 不同离子对酶活的影响
3.3.8 细胞表面展示的G1dh检测L-谷氨酸
3.3.9 谷氨酸实际样品的检测
3.4 本章小结
4 结论
5 展望
参考文献
附录
致谢
作者简介及学术成果