半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)R-spondin2基因的分子克隆、表达模式及其在肌肉发育过程中功能的初步探究

摘要

R-spondin2基因是Rspo基因家族中一员。R-spondin(Rspo)蛋白家族共有4个成员(Rspo1～4)，均为分泌性蛋白，其蛋白结构均含有以下几个典型结构域:N端含有20～25个氨基酸的信号肽区，富含半胱氨酸的弗林类似结构域FU区、Ⅰ型血小板反应结构域TSP1(thrombospondin type1 domain)和C端富含可变数量碱性氨基酸的区域。在小鼠、爪蟾等生物体中的研究显示Rspos可以通过激活以及协同Wnt/β-catenin信号通路，从而参与对细胞增殖和分化的调控，参与影响骨骼、肌肉、血管等组织的发育以及参与四肢和雌雄性腺的分化、发育，并可能在多种疾病的发生过程中起着至关重要的作用。例如，在爪蟾的研究中发现，Rspo2通过激活经典Wnt信号通路，促进β-catenin介导的胚胎肌肉发生，而敲降Rspo2可以显著地阻抑这一过程，表明Rspo2对于依赖于Wnt的胚胎肌肉发生过程非常必要。在小鼠中，敲除对卵母细胞发生起重要作用的Nobox基因后，小鼠卵巢中Rspo2表达水平显著下降，显示Rspo2可能在Nobox下游调控卵母细胞发育，参与雌性生殖系统发育。
　　此外，半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国北方主要的海水养殖名贵鱼类品种之一，具有很高的实用价值和经济价值。然而，半滑舌鳎体重存在雌雄个体二相性差异，对于养殖的半滑舌鳎来说，同龄的成年雌雄个体要比雄性个体大。另外，对于水产养殖鱼类来说，获得健康丰富的肌肉也是比较关注的一点。
　　所以，基于以上情况，本研究试图着重探究R-spondin2基因在半滑舌鳎雌雄性腺分化以及肌肉发育方面潜在的功能。本实验中，通过基因克隆技术得到能够编码完整R-spondin2蛋白氨基酸的ORF序列，对预测的氨基酸序列分析可知其含有Rspo蛋白家族典型的结构，3D蛋白结构模型显示其与斑马鱼、青鳉等物种之间具有高度的蛋白保守性。实时定量PCR实验表明，在胚胎早期发育过程中，R-spondin2基因处于低水平表达，直至原肠发生;在组织中出现脑、鳃、性腺的高表达水平。性腺切片原位杂交结果显示了R-spondin2在精巢和卵巢的生殖细胞中的广泛表达，暗示其在性腺发育中的潜在作用。此外，利用斑马鱼这一模式生物作为研究平台，为研究海洋经济鱼类基因功能提供了可能。我们以显微注射技术为基础，结合斑马鱼整胚染色实验以及胚胎整体原位杂交技术，初步探究得知半滑舌鳎R-spondin2基因对于早期肌肉发育具有潜在重要影响。

目录

声明

摘要

第一章 研究背景

1．R-spondin基因家族介绍以及研究进展

1．1 R-spondin基因蛋白家族的结构和特点

1．2 R-spondin基因家族蛋白各成员功能研究进展

2．R-spondin基因家族与Wnt信号通路的联系

2．1 Wnt信号通路简介

2．2 R-spondin基因家族与Wnt信号通路关系的研究进展

3．本研究的意义以及实验设计思路

第二章 半滑舌鳎R-spondin2基因的分子克隆、表达模式及功能的初步探究

1．实验材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．实验结果及讨论

2．1 半滑舌鳎R-spondin2基因结构分析

2．2 半滑舌鳎R-spondin2基因定量表达分析

2．3 半滑舌鳎R-spondin2基因组织表达分析

2．4 半滑舌鳎R-spondin2基因在肌肉发育过程中功能的初步探究

2．5 R-spondin2抑制Wnt3A对经典Wnt信号通路的激活

参考文献

个人简历

致谢