刺参体腔细胞转录组测序与抗灿烂弧菌感染相关免疫基因的筛选及表达研究

摘要

刺参(Apostichopus japonicus)是目前我国养殖面积较广的品种，具有极高的食用和药用价值，也是我国目前海水养殖经济价值最高的种类。但是随着人工养殖的深入开展，出现了一系列的问题，如病害频发和种质退化，很大程度地制约了刺参养殖的可持续发展。本文以刺参为研究对象，利用新一代测序技术构建刺参的基因表达谱，通过对表达谱进行分析获得差异表达基因，从中筛选潜在的免疫相关基因，并利用实时定量PCR技术(qRT-PCR)初步验证免疫相关基因的表达情况。
　　主要结果如下:
　　对来自同一家系的刺参进行人工攻毒感染实验，可得抗病组(A)、易感组(S)、空白对照组(K)及阴性对照组(C)。提取四组的体腔液RNA，并对其RNA进行转录组测序及基因表达谱分析。通过Illumina测序平台，得到320106172个原始reads，经过去除带接头(adaptor)、低质量（质量值Q≤10的碱基数占整个read的20以上）及比例大于5％的N（N表示无法确定碱基信息）碱基的reads后得到319455942 clean reads。通过软件的拼接组装得到186658个转录本和89891个unigene。这些unigene被分布到GO的三个子类别中—生物过程(9574)、细胞组成(11078)和分子功能(10994)。18887个unigene被注释到KEGG中，有2972个基因有酶活编号，4005个基因参与代谢通路。13126个基因分布到25个KOG类别中。另外，通过比较抗病组和对照组、创伤组的表达谱，得到358个差异显著基因，其中13个上调基因和345个下调基因;同理，通过比较易感组与对照组、创伤组，得到102个差异显著基因，有86个上调基因和16个下调基因。通过参考免疫信号通路及GO、KEGG、NCBI数据库和相关的文献报道，可得到30个潜在的抗病基因及19个易感基因。
　　对上面筛选得到的抗病基因和易感基因进行RT-PCR引物设计，分别设计出24对抗病基因引物和15对易感基因引物，对这些基因进行标准曲线的构建以及相对表达量的检测，结果显示每个基因引物的扩增效果良好。对随机编号的A1-A20基因和S1-S5基因均构建了标准曲线，扩增效率为0.92-1.11，相关系数为0.990-0.999。相对表达量的检测结果表明:A8的表达量上调，与测序结果不符，而其他基因的相对表达量基本与测序结果一致。
　　在本研究中，重新随机抓取一批另一家系的刺参，重新进行人工攻毒感染实验，进行RNA提取及逆转录得cDNA，将其作为模板，对前面筛选的基因进行相对表达量的检测，结果表明:除基因S17外，其他基因的相对表达量与测序结果一致。此外，一些基因可以参与免疫信号通路，主要有5个信号通路，包括溶酶体(Lysosome)、内吞作用(Endocytosis)、趋化因子(Chemokine signalingpathway)、丝分裂原蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)和表皮生长因子信号通路(ERBB signaling pathway)。其中SGSH、DNaseⅡ、ABCA2、AP-3、NEU1和AP-1参与溶酶体作用，RTK、AP-2、PAR6、rabaptin5、CHMP5、VPS37参与内吞作用，JNK、MEKK4、FLNA、NFkB、EGFR参与MAPK信号通路，JNK、NCK、STAT5、ERBB-1参与ERBB信号通路，FOXO、AC(包含2个基因)、STAT5、NFkB参与趋化因子信号通路。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1．养殖刺参病原的研究概况

2．刺参体腔液防御机制的研究进展

3．刺参免疫相关基因的研究进展

4．基因表达谱

5．高通量转录组测序技术的发展

6．免疫信号通路的研究

7．研究目的及意义

第二章 刺参体腔液细胞转录组测序

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．实验结果与分析

2．1 刺参攻毒感染结果

2．2 总RNA提取及文库构建

2．3 测序数据预处理

2．4 数据拼接组装

2．5 基因注释

2．6 生物信息学分析

2．7 SSR、SNP的检测

3 讨论

第三章 不同抗病力刺参体腔液基因的表达谱构建及抗刺参灿烂弧菌免疫相关基因筛选

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．实验结果

2．1 剌参潜在的抗灿烂弧菌相关免疫基因表达谱的构建

2．2 刺参抗灿烂弧菌相关免疫基因的筛选

2．3 刺参的免疫代谢通路

3．讨论

第四章 刺参抗灿烂弧菌相关免疫基因的验证与表达研究

1．实验材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果

2．1 人工感染实验结果

2．2 RNA提取及逆转录

2．3 cDNA合成结果

2．4 引物设计

2．5 荧光定量PCR条件优化

2．6 标准曲线的建立

2．7 候选基因在不同实验组之间的差异情况

2．8 实时荧光PCR结果与测序结果的比较

2．9 基因表达研究结果

2．10 实时荧光PCR结果与测序结果的比较

3．讨论

总结与展望

参考文献

致谢

个人简历

学术成果

附表