保护斑马鱼(Danio rerio)胚胎免受细菌感染的新型母源性LPS结合蛋白ZRANB2的鉴定

摘要

斑马鱼是研究母源性免疫的重要模式生物，已经逐渐成为人们进行免疫学研究的新宠。本文采用高通量分离的方法从斑马鱼胚胎提取液中分离得到一个LPS结合蛋白-ZRANB2。ZRANB2普遍存在于各种生物体中，但是其功能和作用机制所知甚少。本文对ZRANB2进行了生物信息学分析、表达模式分析、体内体外抗菌活性研究以及抗菌活性中心的探寻，初步证明ZRANB2是一个母源性免疫因子。
　　首先，本文分别在分子水平和蛋白水平，证明ZRANB2在斑马鱼各组织中都有表达，卵巢中表达量最高，在胚胎发育早期ZRANB2也大量存在，这说明其确实为一母源性蛋白。其次，通过序列比对发现，斑马鱼ZRANB2与哺乳动物、鸟类、两栖类和硬骨鱼的ZRANB2的一致性在氨基酸水平达到79.2％，80.3％，80.6％和82.3％，这说明ZRANB2的序列比较保守。经三维结构预测得知，斑马鱼ZRANB2与人ZRANB2结构相似，都主要由β折叠片层组成。再次，体外功能验证证明重组ZRANB2(rZRANB2)作为模式识别受体可以识别细菌信号分子LPS，能与革兰氏阴性菌大肠杆菌、鳗弧球菌和嗜水气单胞菌结合，可以作为抗菌效应分子来直接杀死细菌。还对其体内活性进行了验证，将rZRANB2用显微注射技术注入斑马鱼早期胚胎可以显著提高胚胎对斑马鱼病原菌嗜水气单胞菌的抵抗能力，同时注入抗ZRANB2的抗体会让抵抗力明显地降低，而注入抗actin的抗体却没有此作用。最后，证明了Z1/37和Z11/37具有体外抗菌活性，将其注入胚胎也会提高胚胎对嗜水气单胞菌的抵抗力，但是多肽Z38/198却没有相应的抗菌活性。
　　综上所述，本文阐明了ZRANB2是一个母源性LPS结合蛋白，可以通过结合和杀死细菌来保护斑马鱼早期胚胎抵御病原菌的侵袭，这是关于ZRANB2功能的一个新发现。本文为研究动物中普遍存在的锌指蛋白的免疫功能提供了新的视角。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1 斑马鱼简介

2 鱼类的免疫系统

2．1 免疫系统的个体发生

2．2 淋巴器官

2．3 参与免疫反应的细胞

2．4 鱼类的非特异性免疫

2．5 鱼类的特异性免疫

3 先天性免疫

3．1 先天性免疫系统的非自我识别

3．2 先天性免疫与疾病

3．3 母源性免疫与鱼类

4 高通量分离技术

5 锌指蛋白研究概况

5．1 锌指结构

5．2 锌指蛋白

6 ZRANB2的研究概况

7 本文的研究目的和技术路线

7．1 研究目的

7．2 技术路线

第二章 斑马鱼母源性免疫因子的高通量分离与鉴定

1 前言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 从斑马鱼胚胎提取液中高通量分离母源性免疫因子

2．3 Western blowing检测目的蛋白在不同组织和不同发育时期的存在情况

2．4 斑马鱼zranb2基因序列的获得

2．5 斑马鱼zranb2的序列分析、进化分析和基因组织结构分析

2．6 Real-time PCR技术检测斑马鱼zranb2的表达情况

2．7 原位杂交技术检测斑马鱼zranb2的表达情况

2．8 斑马鱼ZRANB2重组蛋白的体外表达

2．9 斑马鱼rZRANB2与LPS结合能力的鉴定

2．10 斑马鱼rZRANB2与细菌结合能力的鉴定

2．11 斑马鱼rZRANB2的抗菌活性的验证

2．12 斑马鱼rZRANB2流式细胞术检测

2．13 斑马鱼胚胎中ZRANB2的抗菌活性的验证

2．14 斑马鱼胚胎中ZRANB2的浓度测定

2．15 斑马鱼ZRANB2活性中心的探寻

3 结果

3．1 从斑马鱼胚胎提取液中高通量分离母源性免疫因子

3．2 斑马鱼zranb2基因的序列分析、结构分析、进化分析和共线性分析

3．3 斑马鱼zranb2在不同组织和不同时期的表达模式

3．4 斑马鱼rZRANB2的体外重组表达

3．5 斑马鱼rZRANB2与LPS结合情况的验证

3．6 斑马鱼rZRANB2与细菌结合情况的验证

3．7 斑马鱼rZRANB2体外抗菌活性的验证

3．8 斑马鱼rZRANB2流式细胞术检测

3．9 斑马鱼早期胚胎中ZRANB2的免疫防护作用的验证

3．10 斑马鱼早期胚胎中ZRANB2浓度的确定

3．11 斑马鱼ZRANB2截短后多肽的抗菌活性的验证

4 讨论

总结与展望

参考文献

致谢

个人简历

发表的文章