文昌鱼补体因子C1q和C3a基因的鉴定、表达和功能研究

摘要

文昌鱼是研究脊椎动物起源与进化的重要模式动物，研究文昌鱼补体系统有助于追溯脊椎动物补体系统的起源。补体系统是先天性免疫的重要组成部分，它能够帮助抗体和吞噬细胞清除病原微生物，从而起到连接先天性免疫和获得性免疫的重要作用，其激活途径一般认为有经典途径、替代途径和凝集素途径3条途径。我们从文昌鱼体内克隆得到补体类C1q基因和C3a基因，并进行了表达和功能研究。具体结果如下。
　　在对文昌鱼基因组中C1q-like基因分析之后，我们从中选择并克隆了一个与脊椎动物C1q序列相似度高、含有与IgG、C1r-C1s结合关键位点的基因。进化分析显示该基因与脊椎动物C1q直系同源，因此我们将之命名为BjC1q。Real-timePCR分析表明BjC1q基因在文昌鱼肝盲囊、后肠和脊索大量表达，并且其表达量在文昌鱼受到免疫刺激（细菌、脂磷壁酸或脂多糖）之后显著上升，这表明BjC1q参与免疫相关功能。接着，我们重组表达并纯化了BjC1q蛋白以及它的胶原结构域和gC1q结构域，并利用ELISA、Western blot、溶血活性测定、亲和层析等技术，重点研究了BjC1q是否具有参与经典激活途径的能力。我们发现重组表达的BjC1q可以形成多聚体，这是C1q激活经典途径所必需的。与人C1q蛋白一样，BjC1q及其gC1q结构域能够与脂磷壁酸、脂多糖结合，甚至还能与人IgG结合。与七鳃鳗C1q不同的是，BjC1q不具备凝集素活性。更重要的是，将BjC1q加入去除了C1q的人血清后，补体经典途径的溶血活性得以恢复。我们还进一步证实BjC1q能够结合并激活人C1r-C1s。以上结果表明，BjC1q具有参与经典激活途径的能力。
　　为了深入探索文昌鱼体内是否存在类C1q介导的补体激活系统，我们又进行了下面一系列实验。首先，利用pull-down技术分离并鉴定了BjC1q的互作蛋白，该蛋白含有三个免疫球蛋白结构域，故命名为BjIgSF。BjIgSF-BjC1q的结合与IgG-C1q的结合相似，都具有激活经典途径的能力。另外，C4和C3沉降实验结果表明，文昌鱼体液具有激活C4和C3的能力，而去除BjC1q的体液或加热至56℃的体液均失去激活能力。将BjC1q加入去除了BjC1q的文昌鱼体液后，体液激活C4和C3的能力可以恢复，证明文昌鱼体液中存在具有激活C4和C3能力的C1q-丝氨酸蛋白酶复合体。BjIgSF、BjC1q-丝氨酸蛋白酶复合体等成分的存在，表明文昌鱼体内存在一个由C1q介导的补体激活途径。我们推测，类似脊椎动物简单的补体典途径可能起源于文昌鱼类C1q介导的补体系统，这是关于脊椎动物经典途径起源的一个新观点。
　　我们还在文昌鱼中克隆得到C3a基因片段，将其命名为BjC3a，并通过原核表达系统对BjC3a进行了重组表达。序列分析和同源建模显示BjC3a蛋白结构与人C3a的结构相似，C-端都是α-螺旋结构。人C3a的C-端α-螺旋部分具有杀菌功能，我们推测BjC3a具有抑菌功能，并通过抑菌实验证实了该推测。另外，BjC3a参与免疫应答的能力与脊椎动物C3a相仿，实验证明BjC3a能够增强鲈鱼巨噬细胞的免疫应答能力，例如引起巨噬细胞的迁移，增强巨噬细胞对细菌的吞噬作用，还能增强巨噬细胞应对细菌时的呼吸爆发作用。我们同时重组表达了去除C-末端精氨酸的BjC3a，命名为BjC3a-desArg，并对其免疫活性进行了同样的检测。脊椎动物C3a的趋化因子功能以及调理功能会随着血清羧肽酶对C3a的C-末端精氨酸的切除而失去，不过抑菌等功能得到保留。实验结果表明BjC3a-desArg也保留了C3a抑菌和刺激呼吸爆发的能力，说明了C3a-desArg的免疫功能在进化过程中的保守性。总之，本次实验证明了无脊椎动物（文昌鱼）BjC3a能够与脊椎动物（鲈鱼）巨噬细胞结合并介导免疫活性，表明在最原始的脊索动物文昌鱼体内已经出现了与脊椎动物补体系统引起的炎症应答类似的免疫反应。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1 文昌鱼—发育与进化生物学的模式动物

1．1 文昌鱼的发现和研究史

1．2 文昌鱼的基本特征

2 文昌鱼免疫系统研究进展

2．1 文昌鱼免疫器官和免疫细胞

2．2 文昌鱼获得性免疫的证据

2．3 文昌鱼先天免疫

2．4 文昌鱼补体系统研究进展

3 C1q研究进展

3．1 C1q蛋白的结构和功能

3．2 含C1q球状结构域蛋白家族

4 C3a研究进展

4．1 C3a蛋白的结构和功能

4．2 C3a的抗菌机理

5 实验目的和研究路线

第二章 文昌鱼C1q-like基因的克隆、表达及功能分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 文昌鱼BjC1q基因全长的克隆

2．2 BjC1q基因序列分析

2．3 BjC1q基因RNA水平组织分布研究

2．4 文昌鱼经细菌刺激后体内BjC1q基因RNA水平的变化研究

2．5 BjC1q全长蛋白以及各结构域的重组表达

2．6 BjC1q蛋白与脂多糖、脂磷壁酸的结合实验

2．7 BjC1q蛋白与人IgG的结合实验

2．8 文昌鱼体内与BjC1q互作蛋白的研究

2．9 BjC1q蛋白的凝集实验

2．10 BjC1q蛋白参与的溶血实验

2．11 以ELISA为基础的经典途径检测

2．12 BjC1q与C1r／C1s／MASP的结合实验

2．13 文昌鱼体液中BjC1q的功能研究

3 实验结果

3．1 文昌鱼BjC1q基因全长的克隆

3．2 BjC1q基因序列分析

3．3 BjC1q基因组织特异性表达

3．4 文昌鱼经细菌刺激后体内BjC1q基因RNA水平的变化

3．5 BjC1q全长蛋白及gC1q结构域和胶原域的重组表达

3．6 BjC1q蛋白与脂多糖、脂磷壁酸的结合实验结果

3．7 BjC1q蛋白与人IgG的结合实验结果

3．8 文昌鱼体内与BjC1q互作蛋白的研究结果

3．9 BjC1q蛋白无凝集活性

3．10 BjC1q蛋白参与的溶血实验结果

3．11 以ELISA为基础的经典途径检测结果

3．12 BjC1q与C1r／C1s／MASP的结合实验结果

3．13 文昌鱼体液中BjC1q的功能

4 讨论

第三章 文昌鱼C3a的克隆、表达及功能分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 文昌鱼体液补体活性实验

2．2 文昌鱼C3a片段的基因克隆

2．3 序列分析与同源建模

2．4 BjC3a的重组表达与纯化

2．5 BjC3a蛋白的抑菌实验

2．6 BjC3a蛋白的趋化实验

2．7 BjC3a蛋白对巨噬细胞吞噬作用的影响

2．8 BjC3a蛋白对巨噬细胞呼吸爆发的影响

2．9 BjC3a热稳定性检测

3 实验结果

3．1 文昌鱼体液补体活性

3．2 文昌鱼C3a片段的基因克隆

3．3 序列分析与同源建模

3．4 BjC3a的重组表达与纯化

3．5 BjC3a蛋白的抑菌实验结果

3．6 BjC3a蛋白的趋化实验结果

3．7 BjC3a蛋白对巨噬细胞吞噬作用的影响

3．8 BjC3a蛋白对巨噬细胞呼吸爆发的影响

3．9 BjC3a热稳定性检测结果

4 讨论

总结与展望

参考文献

致谢

个人简历

发表的学术论文