外源寡核苷酸对大肠杆菌和双歧杆菌生长的影响

摘要

近年来，核酸营养及安全性人们越来越多的关注。核苷酸对生物体具有多种有益功能，如抗氧化、提高机体免疫力、促进细胞分化、促进肠黏膜生长、减少腹泻的发生等，并被广泛地添加到婴幼儿的配方奶粉中。然而，日常摄入的饮食中，除了含单核苷酸外，更多的是基因组DNA等大分子核酸，它们经胃肠道消化后生成的寡核苷酸将成为肠道微生物面对的主要核酸成分。但有关寡核苷酸对肠道微生物影响的研究较为欠缺，本研究选取了两种寡核苷酸（长度为39 nt和61 nt），初步探究了其对两种典型肠道微生物——大肠杆菌和双歧杆菌生长的影响。主要研究内容与结果如下:
　　1.探究寡核苷酸对两种细菌生长的影响。将两种寡核苷酸分别加入到大肠杆菌和双歧杆菌单独培养的酵母粉缺乏培养基中，根据平板菌落计数法研究究其对两种细菌生长的影响。结果显示，两种寡核苷酸对单独培养的两种细菌都有促进生长的作用，说明细菌在营养缺乏时能够利用外源的寡核苷酸。由于肠道中多菌共生，本研究将大肠杆菌和双歧杆菌混合培养，加入外源寡核苷酸，根据两种细菌的16S rRNA和荧光定量PCR技术定量两种细菌。结果显示，寡核苷酸对混合培养中的双歧杆菌有明显的促进作用，其促进作用明显高于对大肠杆菌的促进作用，分析原因是双歧杆菌的生长对大肠杆菌有明显的抑制作用。
　　2.研究寡核苷酸在细菌中的稳定性。通过模拟分析了寡核苷酸在细菌中的存在状态，以期研究寡核苷酸以何种形式被细菌利用。具体方法是，超声破碎细菌，后将寡核苷酸片段加入到破碎的细胞液中，用凝胶电泳检测其在细胞液中不同时间后的稳定性。结果显示，寡核苷酸进入菌体前在培养液中保持完整的状态，直到进入细菌细胞液中才被降解，寡核苷酸在两种菌液中降解速度的差异可能与两种细菌液中的核酸酶的种类及浓度有关。
　　3.研究寡核苷酸的讲解产物对两种细菌生长的影响。通过探究寡核苷酸的可能降解产物单核苷酸、核糖、碱基等对细菌生长的影响，分析了寡核酸可能被细菌利用的形式。结果表明，单核苷酸对细菌的作用效果与寡核苷酸相似，其能促进单独培养的两种细菌的生长并且能促进混合培养细菌中双歧杆菌的生长;核糖和碱基对双歧杆菌促生长作用不如单核苷酸明显。因此，寡核苷酸进入细菌后被利用的主要形式可能是其降解产生的寡核苷酸或单核苷酸产物。
　　综上所述，本研究发现在培养基中营养缺乏时，完整的外源寡核苷酸能被大肠杆菌和双歧杆菌直接吸收，并可能通过寡核苷酸在菌体内的降解获得更小的寡核苷酸或单核苷酸，进而被菌体利用，促进细菌的生长;在混合培养的细菌体系中，相比大肠杆菌外源寡核苷酸能够显著促进有益菌——双歧杆菌的生长，同时双歧杆菌能抑制大肠杆菌的生长，达到维持肠道微生态平衡的效果。本研究的结果将对饮食摄入核酸及特殊人群补充核酸起到一定的指导意义。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1 肠道微生态

0．1．1 肠道微生物的屏障及免疫功能

0．1．2 肠道微生物紊乱与疾病的关系

0．1．3 肠道中的双歧杆菌和大肠杆菌

0．2 外源核酸在体内的消化情况

0．2．1 外源核酸在肠道中残存

0．2．2 外源核酸的水平转移

0．3 核酸功能研究

0．3．1 核酸的免疫功能

0．3．2 外源核苷酸维持肠道菌群的稳态

0．3．2 外源核苷酸酸促进生长发育

0．4 16S rRNA定量细菌的方法

0．4．1 16S rRNA及其特点

0．4．2 16S rRNA在鉴定和分类细菌方面的应用

0．4．3 16S rRNA定量细菌的原理

0．4．4 16S rRNA定量细菌的步骤

0．4．5 16S rRNA定量细菌的优点

0．5 本研究的目的意义及主要内容

0．5．1 本研究的目的和意义

0．5．2 本研究的主要内容

1 寡核苷酸对两种细菌体外生长的影响

1．1 引言

1．2 实验材料

1．2．1 实验仪器

1．2．2 实验试剂

1．2．3 实验所用菌种

1．3 实验方法

1．3．1 两种细菌培养基的配制

1．3．2 两种细菌的保存和活化

1．3．3 两种细菌在核酸缺乏型培养基中的生长曲线的测定

1．3．4 荧光定量PCR标准曲线的制作

1．3．5 探究寡核苷酸片段对两种细菌单独生长的影响的方法

1．3．6 探究寡核苷酸片段对两种细菌混合培养的影响的方法

1．3．7 细菌基因组DNA的提取

1．3．8 荧光定量PCR反应体系

1．4 结果与讨论

1．4．1 大肠杆菌在两种培养基中的生长曲线

1．4．2 寡核苷酸对两种细菌单独生长的影响

1．4．3 荧光定量PCR标准曲线的建立结果

1．4．4 寡核苷酸对混合培养的两种细菌生长的影响

1．5 本章小结

2 寡核苷酸片段在细菌中的稳定性探究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验仪器

2．3．2 实验试剂

2．3．3 实验所用寡核苷酸

2．4 实验方法

2．4．1 探究两种寡核苷酸在培养基中的稳定性的方法

2．4．2 细菌的破碎方法

2．4．3 细菌破碎液总蛋白含量的测定

2．4．4 探究两种寡核苷酸片段在细菌破碎液中的稳定性的方法

2．4．5 电泳分析

2．5 实验结果与讨论

2．5．1 两种细菌液中的蛋白含量

2．5．2 两种寡核苷酸在大肠杆菌培养基中的稳定性

2．5．3 两种寡核苷酸在双歧杆菌培养基中的稳定性

2．5．4 两种寡核苷酸片段在大肠杆菌细胞液中的稳定性

2．5．5 两种寡核苷酸在双歧杆菌细胞液中的稳定性

2．6 本章小结

3 寡核苷酸降解产物对两种细菌体外生长的影响

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验试剂

3．3 实验方法

3．3．1 单核苷酸混合物、碱基、核糖的配制

3．3．2 探究单核苷酸混合物对两种细菌单独生长的影响

3．3．3 单核苷酸混合物对两种细菌混合培养的影响

3．3．4 脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸对双歧杆菌生长的影响

3．3．5 核糖和碱基对双歧杆菌生长的影响

3．3 实验结果

3．3．1 单核苷酸混合物对双歧杆菌生长的影响

3．3．2 单核苷酸混合物对大肠杆菌生长的影响

3．3．3 单核苷酸混合物对两种细菌混合生长的影响

3．3．4 核苷酸的降解产物核糖及碱基对双歧杆菌生长的影响

3．3．5 核糖及脱氧核糖对双歧杆菌生长的影响

3．3．6 比较脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸对细菌生长的影响

3．6 本章小结

4 论文结论

参考文献

附录

致谢

个人简历

研究生期间发表的研究成果