青岛文昌鱼铜蓝蛋白基因的克隆、表达和调控与肝脏的起源

摘要

铜蓝蛋白是一种含铜的α-糖蛋白，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物体内。在肝脏中，新合成的铜蓝蛋白前体在分泌的早期与铜相结合，伴随着多糖的修饰形成铜蓝蛋白，进一步释放到血液中。铜蓝蛋白最突出的功能是:(1)结合血清中的铜（血液中95％的铜与铜蓝蛋白结合）和(2)通过自身的亚铁氧化酶活性抑制铁离子产生自由基，此外，铜蓝蛋白在胚胎及神经系统的发育、新生毛细血管的形成、自由基的清除等过程中发挥重要作用。
　　铜蓝蛋白是多铜氧化酶家族的重要成员。多铜氧化酶家族是极少数能氧化底物并将氧分子氧化为两个水分子的一类酶。目前已确认的多铜氧化酶有三类分别为:铜蓝蛋白、膜铁转运蛋白和胎盘铁转运蛋白。该家族具有亚铁氧化酶活性，对铁具有高度的亲和性，能够有效的将Fe2+氧化为Fe3+，在机体内的铁代谢方面具有重要意义。铜蓝蛋白通过抑制Fe2+参与Fenton和Haber-Weiss反应生成的自由基，减少Fe2+积累所导致的毒性。因此铜蓝蛋白对体内铁代谢以及和体内铁浓度的调节具有十分重要的作用。
　　头索动物文昌鱼，处于脊索动物门的基部，占据了无脊椎动物进化到脊椎动物的重要节点。文昌鱼成为了研究脊椎动物起源与进化的重要的模式生物。过去的众多研究表明，在文昌鱼中存在类似于脊椎动物肝脏的组织，被称为肝盲囊。在脊椎动物中肝脏是铜蓝蛋白合成的重要器官，同时在铁的贮存和解毒方面发挥着重要作用，铜蓝蛋白在细胞内铁的代谢和降低Fe2+毒性方面具有重要作用。虽然铜蓝蛋白广泛分布于无脊椎动物和脊椎动物中，但目前大量的研究针对的仅是脊椎动物中的铜蓝蛋白，在无脊椎动物当中有关铜蓝蛋白的表达和调控的研究则比较有限。
　　在本实验中，首先对文昌鱼中铜蓝蛋白的进行了鉴定、进化分析与组织表达研究。文昌鱼铜蓝蛋白的cDNA的开放阅读框(ORF)是3534 bp，开放阅读框编码1178个氨基酸的蛋白质，成熟蛋白的分子质量约为130.85 kDa，等电点(PI)为4.83。该蛋白质属于多铜氧化酶家族，具有该家族特有的Cu-oxidase结合结构域。通过序列比对发现此预测的蛋白序列与脊椎动物的铜蓝蛋白具有42.7％到46.1％的相似性，与无脊椎动物有20.7％到49.7％的相似性。虽然文昌鱼的序列与人的序列相似性只有45.8％，但是它们的3D结构却具有惊人的相似性，这说明了文昌鱼铜蓝蛋白与人的功能可能也具有一定的相似性。我们通过实时荧光定量聚合酶反应检测到它在文昌鱼各个组织中均有表达，在肝盲囊表达量最高，具有组织特异性表达的特点。此外，在文昌鱼经过铁离子或脂多糖处理后，铜蓝蛋白的表达量均会有不同程度的上调。这些表明，铜蓝蛋白似乎是一个在铁代谢和免疫反应两方面具有双重功能的蛋白质。
　　本文论述了文昌鱼的铜蓝蛋白在合成分布以及结构和功能方面与脊椎动物的铜蓝蛋白存在的相似性。这些结果都为文昌鱼中肝盲囊与脊椎动物的肝脏同源并且在维持体内铁的稳态中发挥重要作用这一推论提供了证据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 文昌鱼及其生物学意义

1．1 文昌鱼的形态特征及其功能

1．2 文昌鱼的生活习性及地理分布

1．3 文昌鱼研究的生物学意义

2 文昌鱼与脊椎动物组织器官的同源性

2．1 肝盲囊与肝脏

2．2 哈氏窝与垂体

2．3 内柱与甲状腺

3．文昌鱼的免疫反应

4 铜蓝蛋白

4．1 铜蓝蛋白的研究概况

4．2 铜蓝蛋白的结构

4．3 铜蓝蛋白的组织合成与分布

4．4 铜蓝蛋白的生理功能

5 铜蓝蛋白与疾病

5．1 铜蓝蛋白与遗传性血浆铜蓝蛋白缺乏症

5．2 铜蓝蛋白与威尔逊氏病

5．3 铜蓝蛋白与帕金森病

5．4 铜蓝蛋白与其他相关疾病

6 铜蓝蛋白与海洋生物的研究进展

7 本文的研究目的及技术路线

7．1 研究目的

7．2 研究的背景及意义

7．3 技术路线

第二章 文昌鱼Cp基因的克隆、表达和调控

0 前言

1 实验材料

1．1 实验试剂

1．2 实验仪器

1．3 主要溶液的配制

1．4 文昌鱼的控养

2 实验方法

2．1 总RNA的制备及cDNA的获得

2．2 文昌鱼Cp基因全长序列的克隆

2．3 文昌鱼Cp生物信息学分析

2．4 文昌鱼各组织取材

2．5 Real-time PCR检测

3 结果

3．1 文昌鱼Cp基因全长序列的克隆

3．2 文昌鱼Cp生物信息学分析

3．3 Real-time PCR检测文昌鱼Cp在不同组织的表达

3．4 文昌鱼处理样本中Cp的表达

4 讨论

4．1 文昌鱼铜蓝蛋白是脊椎动物铜蓝蛋白的祖先型

4．2 文昌鱼Cp参与机体的免疫反应

4．3 文昌鱼Cp参与机体的铁的代谢

5 结论

参考文献

致谢

作者简介