黄东海泥质区沉积物氨氧化古菌和氨氧化细菌amoA基因的空间分布

摘要

好氧氨氧化过程作为硝化作用的主要限速步骤，是氮的生物地球化学循环的关键环节，由氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)和氨氧化细菌(ammonia-oxidizing archaea，AOB)驱动。AOA和AOB在自然界中广泛存在，它们的相对丰度、群落结构和活性因环境而异，目前二者对全球氮循环的相对贡献仍存在争议。氨单加氧酶（ammonia monooxygenase，AMO）是催化好氧氨氧化作用的关键酶，在AOA和AOB中广泛存在，其α亚基的编码基因（amoA）常作为研究氨氧化微生物多样性和丰度的标记基因。目前，在很多低氧海洋环境中发现了大量amoA且检测到较高的硝化速率，这些适应低氧环境的氨氧化微生物类群可能有别于富氧环境中的类群。
　　黄海和东海是位于中国大陆和朝鲜半岛之间的、受海陆因素共同影响的半封闭式边缘海，包含多个泥质区，不同泥质区的理化环境差异较大，而环境差异极可能导致这些泥质区中微生物群落结构差异。目前，针对黄、东海泥质区沉积物样品中AOA和AOB群落分布的研究尚未开展，关于AOA和AOB在沉积物中的垂直分布的研究及二者分布的对比也极少报道。本论文对黄、东海不同泥质区沉积物中AOA和AOB的群落结构和丰度的垂直变化做了详细的描述，并对比了不同泥质区氨氧化微生物群落结构及同一泥质区AOA和AOB分布的差异，进一步分析了它们与不同环境因子的相关性。填补了对中国边缘海泥质区沉积物中氨氧化微生物群落结构研究的空白，为全面了解环境因子对沉积物中氨氧化微生物分布的影响及氨氧化微生物在氮的生物地球化学循环中的作用提供理论依据，也为研究氨氧化微生物在深层低氧沉积物中的生存机制提供更多资料。
　　2013年7月随“东方红2号”科考船采集长江口泥质区、闽浙沿岸泥质区、济州岛西南泥质区和南黄海中部泥质区四个不同泥质区的ECS01、ECS02、ECS03、SYS01和SYS025个站位不同深度的沉积物。构建了5个站位表、中、底3层沉积物样品的古菌和细菌amoA基因克隆文库。共得到613条古菌amoA基因序列和549条细菌amoA基因序列，在5％的cutoff水平上分别划分为83个和37个OTUs。多样性指数分析表明，AOA的多样性水平总体上高于AOB;从垂直方向来看，AOA和AOB多样性水平随着深度的增加而降低;而从水平方向来看，西太平洋边缘海表层沉积物中AOA多样性水平随纬度升高而降低，AOB趋势恰好相反。相关性分析表明，AOA多样性水平与PO43-呈负相关，而AOB多样性水平分别与TOC％、TN％和NO3-呈正相关。AOA主要由Nitrosopumilus和Nitrososphaera两个类群构成，其中Nitrosopumilus是优势类群，包括Cluster1、2、4、6、7、8、9.1、12、15、16和新定义的Cluster17; AOB可分为Nitrosospira和Nitrosomonas两个分支，且Nitrosospira为优势类群。盐度是决定优势类群的关键因素，沉积物的运输距离和时间对沉积物中Nitrosospira和Nitrosomonas的相对丰度也有一定影响。根据所在样品的深度，可将AOA和AOB划分为三大类群:第一类仅存在于表层沉积物中，第二类仅存在于底层沉积物中，第三类在表底层沉积物中均存在，溶氧浓度是主要的影响因素。不同站位之间的群落结构差异大于同一站位不同深度群落结构之间的差异。在所测环境因子中δ15NTN、NH4+和SiO32-，NO3和δ13C分别与AOA和AOB的群落结构显著相关。
　　5站8层共40个沉积物样品的荧光定量PCR分析结果显示:古菌amoA基因丰度在8.11×103-6.09×105 copies/g之间，ECS02站的丰度最高;细菌amoA基因丰度在2.34×104-4.31×106 copies/g之间，ECS01站的丰度最高。从总体水平上看，细菌amoA基因丰度高于古菌;从不同海区来看，东海3个泥质区古菌和细菌amoA基因丰度高于南黄海;从水平方向来看，西太平洋边缘海表层沉积物中氨氧化古菌amoA基因的丰度随纬度降低而增加，氨氧化细菌amoA基因的丰度随纬度变化无明显规律。从垂直方向来看，古菌和细菌amoA基因丰度在表层5 cm样品中呈现波动变化，之后随着深度的增加而降低，且细菌的下降趋势更明显。古菌amoA基因的丰度与PO43-浓度呈负相关，与SiO32-的浓度呈正相关;细菌amoA基因的丰度与NO3-浓度呈正相关，与SiO32-的浓度呈负相关。以上结果表明黄东海泥质区沉积物中AOA和AOB的多样性丰富、丰度高且对环境因子有不同的响应，AOA与AOB之间以及它们当中不同类群之间存在生态位分化现象，对这一区域AOA和AOB的研究将对海洋泥质沉积物生态系统中氨氧化微生物的认识有重要意义。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 氨氧化微生物的研究进展

1．1．1 参与氮的生物地球化学循环的微生物

1．1．2 好氧氨氧化微生物概述

1．1．3 好氧氨氧化微生物系统发育

1．1．4 对环境因子的响应

1．1．5 氮氧化古菌和细菌的代谢途径

1．1．6 氨氧化古菌和氨氧化细菌在海洋中的分布及其对海洋氮循环的贡献

1．2 研究区域概况

1．2．1 中国东部边缘海概述

1．2．2 黄、东海泥质区概述

1．3 氨氧化微生物群落结构的主要研究方法

1．3．1 DGGE

1．3．2 克隆文库测序

1．3．3 高通量测序

1．3．4 荧光原位杂交技术

1．3．5 荧光定量PCR

1．4 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 样品采集

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 构建amoA基因克隆文库

2．2．2 荧光定量PCR

2．2．3 环境因子测量

2．2．4 数据分析

2．3 序列提交

3 实验结果与分析

3．1 环境因子分析

3．2 氨氧化古菌amoA基因克隆文库分析

3．2．1 氨氧化古菌amoA基因扩增结果

3．2．2 氨氧化古菌amoA基因文库群落组成分析

3．2．3 氨氧化古菌amoA基因克隆文库覆盖率与稀释曲线

3．2．4 氨氧化古菌amoA基因文库多样性指数分析

3．2．5 氨氧化古菌amoA基因系统发育分析

3．2．6 氨氧化古菌amoA基因聚类分析

3．2．7 氨氧化古菌amoA基因群落结构和环境因子相关性分析

3．3 氨氧化细菌amoA基因克隆文库分析

3．3．1 氨氧化细菌amoA基因扩增结果

3．3．2 氨氧化细菌amoA基因文库群落组成分析

3．3．3 氨氧化细菌amoA基因克隆文库覆盖率与稀释曲线

3．3．4 氨氧化细菌amoA基因文库多样性指数分析

3．3．5 氨氧化细菌amoA基因系统进化分析

3．3．6 氨氧化细菌amoX基因聚类分析

3．3．7 氨氧化细菌amoA基因群落结构和环境因子相关性分析

3．4 氨氧化古菌及细菌amoA基因序列号

3．5 氨氧化古菌amoA基因定量分析

3．5．1 氨氧化古菌amoA基因标准曲线

3．5．2 氨氧化古菌amoA基因拷贝数

3．6 氨氧化细菌amoA基因定量分析

3．6．1 氨氧化细菌amoA基因标准曲线

3．6．2 氨氧化细菌amoA基因拷贝数

3．7 古菌与细菌amoA丰度比较

3．8 amoA基因多样性和丰度与环境因子相关性分析

4 讨论

4．1 氨氧化细菌和古菌的群落组成

4．2 不同类群AOA和AOB生态位分化

4．3 细菌和古菌amoA基因的丰度

4．4 氨氧化细菌和古菌对环境因子的响应

结论

参考文献

致谢

个人简历

参与发表的学术论文