抗菌肽Pt5e高表达、纯化及其对多重耐药性细菌的抑菌活性

摘要

斑马鱼卵黄高磷蛋白(Pv)具有抑菌活性，活性中心位于C端的55个氨基酸残基，这段多肽即为抗菌肽Pt5，而Pt5e则是Pt5的一个抑菌活性更强的突变体（Pt5的第48位Arg突变为Leu）。Pt5e具有较强的抑菌活性和其他多种免疫调节功能，同时不会破坏人体的正常细胞，因此在许多领域表现出很高的研究价值和应用价值，特别是在抗生素滥用以及耐药性细菌不断出现的今天，Pt5e具有成为新型抗菌药物的潜力。
　　目前对Pt5e的重组表达策略是以大肠杆菌为宿主，通过与His标签融合表达，使用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化。但是，在这一套异源表达和分离纯化系统下Pt5e的表达量相对较低，很难满足对Pt5e的进一步研究和开发的需要。因此，开发新型的Pt5e的高表达系统成为了解决这一问题的关键。
　　类弹性蛋白(ELP)标签是一种新型的分离纯化重组蛋白的标签，只需要通过离心等步骤就能分离纯化得到目的蛋白，并且能够使目的蛋白的表达量有很大的提高。因此，本研究将一段经过设计的阳离子类弹性蛋白(CELP)标签与Pt5e融合表达，用以提高重组Pt5e的产量，并且测试其对多重耐药性(MDR)细菌的抑菌活性。
　　首先，采用定向回归连接（RDL）法将4段合成的CELP[KV7F-9]单体基因串联成低聚化的CELP[KV7F-36]基因。接着对CELP[KV7F-36]基因和Pt5e基因进行修饰，在两段基因之间插入肠激酶底物的基因，用来在表达后去除CELP标签。构建完成融合蛋白表达载体pET28a-CELP[KV7F-36]-ENK-Pt5e后，使用大肠杆菌作为宿主，采用自诱导表达系统进行融合蛋白的重组表达。之后，通过可逆相变循环(ITC)分离纯化融合蛋白，并在肠激酶消化释放出重组Pt5e后通过同样的方法对重组Pt5e进行分离纯化。最后，比较CELP标签法与His标签法的产量，并测试重组Pt5e对MDR细菌的抑菌活性。
　　结果表明，CELP标签与Pt5e融合表达后，可以通过ITC法顺利地将融合蛋白及重组Pt5e分离纯化，并能够大幅提高重组Pt5e的产量。CELP标签法生产重组Pt5e的产量为每100mL培养基1.47 mg，是His标签法的近20倍。此外，重组Pt5e能够在较低浓度时杀灭实验用5株致病MDR细菌，表现出了较强的抑菌活性。透射电镜实验观察到重组Pt5e可以破坏实验用5株致病MDR细菌的细胞壁，造成细菌的死亡。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1 Pt5e的概述

1．1 鱼类的母源性免疫

1．2 卵黄高磷蛋白的抑菌活性

1．3 抗菌肽Pt5及其突变体Pt5e

2 抗菌肽

2．1 抗菌肽的概述

2．2 抗菌肽的生产方式

2．3 抗菌肽表达的异源系统

3 类弹性蛋白(ELP)

3．1 ELP的概述

3．2 ELP的相变机理

3．3 ELP标签在重组蛋白分离纯化中的应用

4 研究目的和技术路线

4．1 研究目的

4．2 技术路线

第二章 抗菌肽Pt5e高表达、纯化及其对多重耐药性细菌的抑菌活性研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 实验结果

3．1 表达载体的构建

3．2 融合蛋白的表达

3．3 融合蛋白的分离纯化

3．4 Pt5e的分离纯化

3．5 CELP标签法与His标签法产量比较

3．6 抑菌活性测试

3．7 透射电镜观察

4 讨论

总结

参考文献

附录

致谢

个人简历